水稻是我國及黑龍江省重要的糧食作物,黑龍江省地處中國最北端,是世界水稻栽培的北限,低溫冷害發(fā)生頻繁。冷害可導(dǎo)致水稻大幅度減產(chǎn)。不同水稻品種耐冷性不同,培育耐冷品種是防治低溫冷害最有效的措施。研究及克隆水稻耐冷的相關(guān)基因,有利于水稻耐冷育種工作。黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點實驗室構(gòu)建了耐冷水稻空育131和冷敏感水稻龍粳11低溫脅迫數(shù)字表達譜。本研究根據(jù)低溫脅迫水稻數(shù)字表達譜,選取了與光合作用有關(guān)、低溫脅迫響應(yīng)基因OsRBCS3;分析了在低溫脅迫下耐冷水稻空育131和冷敏感水稻龍粳11間OsRBCS3基因表達量;對比了OsRBCS3基因在空育131與龍粳11間的序列差異;構(gòu)建了水稻空育131 OsRBCS3基因的超量表達載體及CRISPR/Cas9敲除載體;通過遺傳轉(zhuǎn)化研究了空育131 OsRBCS3基因的功能。研究的主要結(jié)果包括:1.耐冷水稻空育131及冷敏感水稻龍粳11孕穗期低溫脅迫后,空育131的OsRBCS3基因表達量上調(diào)幅度大于龍粳11。從空育131和龍粳11中克隆的OsRBCS3基因序列相同,CDS區(qū)均為528bp,編碼175個氨基酸。兩個水稻品種耐冷性差異可能是OsRB... 

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第1章 前言
    1.1 水稻耐冷機理研究進展
        1.1.1 冷害與水稻生產(chǎn)
        1.1.2 水稻冷害的類型
        1.1.3 水稻耐冷性生理研究進展
    1.2 RuBisCO在逆境脅迫中的作用
        1.2.1 RuBisCO的結(jié)構(gòu)及功能
        1.2.2 OsRBCS基因在植物抗逆中的應(yīng)用
    1.3 抗性標記基因hpt在水稻中的應(yīng)用
    1.4 基因編輯技術(shù)研究進展
        1.4.1 ZFN基因組編輯技術(shù)
        1.4.2 TALENs基因組編輯技術(shù)
        1.4.3 CRISPR/Cas基因組編輯技術(shù)
    1.5 研究目的及意義
第2章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要菌株及質(zhì)粒
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器與設(shè)備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 水稻空育131耐冷候選基因的確定
        2.2.2 水稻OsRBCS3基因的克隆及分析
        2.2.3 水稻空育 131 OSRBCS3基因超量表達及敲除載體構(gòu)建
        2.2.4 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.5 T_0代水稻檢測鑒定
        2.2.6 T_1代水稻檢測鑒定
第3章 結(jié)果與分析
    3.1 水稻空育131耐冷候選基因
        3.1.1 低溫脅迫下水稻總RNA提取及cDNA合成
        3.1.2 水稻OsRBCS3基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)
    3.2 水稻OsRBCS3基因克隆及分析
        3.2.1 水稻OsRBCS3基因全長的擴增
        3.2.2 水稻OsRBCS3基因入門載體的構(gòu)建
        3.2.3 水稻OsRBCS3基因DNA序列分析
    3.3 空育 131 OsRBCS3基因超量表達及敲除載體的構(gòu)建
        3.3.1 超量表達載體
        3.3.2 CRISPR/Cas9敲除載體
    3.4 空育 131 OsRBCS3基因?qū)λ镜倪z傳轉(zhuǎn)化
        3.4.1 根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的鑒定
        3.4.2 水稻成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)
        3.4.3 水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系
        3.4.4 遺傳轉(zhuǎn)化水稻的獲得
    3.5 T_0代水稻檢測鑒定
        3.5.1 外源基因PCR檢測
        3.5.2 潮霉素基因表達
        3.5.3 CRISPR/Cas9靶點編輯情況
        3.5.4 水稻孕穗期耐冷性
    3.6 T_1代水稻檢測鑒定
        3.6.1 CRISPR/Cas9靶點編輯情況
        3.6.2 水稻OsRBCS3基因的mRNA表達量
        3.6.3 水稻苗期耐冷性
第4章 討論
    4.1 水稻耐冷響應(yīng)基因的選擇
    4.2 遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化
    4.3 潮霉素篩選方法的探究
    4.4 CRISPR-CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在水稻中的應(yīng)用
    4.5 耐冷候選基因OsRBCS3的功能驗證
    4.6 下一步的工作展望
第5章 結(jié)論
參考文獻
附錄 1 培養(yǎng)基及試劑的配制
附錄 2 CTAB法提取植物總DNA
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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[4]不同啟動子驅(qū)動Rc基因在轉(zhuǎn)基因水稻中表達的研究[D]. 楊晴晴.揚州大學(xué) 2013
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