發(fā)布時間：2022-10-09 13:31

　　水稻是我國及黑龍江省重要的糧食作物,黑龍江省地處中國最北端,是世界水稻栽培的北限,低溫冷害發(fā)生頻繁。冷害可導致水稻大幅度減產。不同水稻品種耐冷性不同,培育耐冷品種是防治低溫冷害最有效的措施。研究及克隆水稻耐冷的相關基因,有利于水稻耐冷育種工作。黑龍江省普通高等學校分子生物學重點實驗室構建了耐冷水稻空育131和冷敏感水稻龍粳11低溫脅迫數字表達譜。本研究根據低溫脅迫水稻數字表達譜,選取了與光合作用有關、低溫脅迫響應基因OsRBCS3;分析了在低溫脅迫下耐冷水稻空育131和冷敏感水稻龍粳11間OsRBCS3基因表達量;對比了OsRBCS3基因在空育131與龍粳11間的序列差異;構建了水稻空育131 OsRBCS3基因的超量表達載體及CRISPR/Cas9敲除載體;通過遺傳轉化研究了空育131 OsRBCS3基因的功能。研究的主要結果包括:1.耐冷水稻空育131及冷敏感水稻龍粳11孕穗期低溫脅迫后,空育131的OsRBCS3基因表達量上調幅度大于龍粳11。從空育131和龍粳11中克隆的OsRBCS3基因序列相同,CDS區(qū)均為528bp,編碼175個氨基酸。兩個水稻品種耐冷性差異可能是OsRB... 

【文章頁數】：86 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第1章 前言
    1.1 水稻耐冷機理研究進展
        1.1.1 冷害與水稻生產
        1.1.2 水稻冷害的類型
        1.1.3 水稻耐冷性生理研究進展
    1.2 RuBisCO在逆境脅迫中的作用
        1.2.1 RuBisCO的結構及功能
        1.2.2 OsRBCS基因在植物抗逆中的應用
    1.3 抗性標記基因hpt在水稻中的應用
    1.4 基因編輯技術研究進展
        1.4.1 ZFN基因組編輯技術
        1.4.2 TALENs基因組編輯技術
        1.4.3 CRISPR/Cas基因組編輯技術
    1.5 研究目的及意義
第2章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要菌株及質粒
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器與設備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 水稻空育131耐冷候選基因的確定
        2.2.2 水稻OsRBCS3基因的克隆及分析
        2.2.3 水稻空育 131 OSRBCS3基因超量表達及敲除載體構建
        2.2.4 根瘤農桿菌介導的水稻遺傳轉化
        2.2.5 T_0代水稻檢測鑒定
        2.2.6 T_1代水稻檢測鑒定
第3章 結果與分析
    3.1 水稻空育131耐冷候選基因
        3.1.1 低溫脅迫下水稻總RNA提取及cDNA合成
        3.1.2 水稻OsRBCS3基因對低溫脅迫的響應
    3.2 水稻OsRBCS3基因克隆及分析
        3.2.1 水稻OsRBCS3基因全長的擴增
        3.2.2 水稻OsRBCS3基因入門載體的構建
        3.2.3 水稻OsRBCS3基因DNA序列分析
    3.3 空育 131 OsRBCS3基因超量表達及敲除載體的構建
        3.3.1 超量表達載體
        3.3.2 CRISPR/Cas9敲除載體
    3.4 空育 131 OsRBCS3基因對水稻的遺傳轉化
        3.4.1 根瘤農桿菌轉化子的鑒定
        3.4.2 水稻成熟胚愈傷組織誘導
        3.4.3 水稻遺傳轉化體系
        3.4.4 遺傳轉化水稻的獲得
    3.5 T_0代水稻檢測鑒定
        3.5.1 外源基因PCR檢測
        3.5.2 潮霉素基因表達
        3.5.3 CRISPR/Cas9靶點編輯情況
        3.5.4 水稻孕穗期耐冷性
    3.6 T_1代水稻檢測鑒定
        3.6.1 CRISPR/Cas9靶點編輯情況
        3.6.2 水稻OsRBCS3基因的mRNA表達量
        3.6.3 水稻苗期耐冷性
第4章 討論
    4.1 水稻耐冷響應基因的選擇
    4.2 遺傳轉化體系的優(yōu)化
    4.3 潮霉素篩選方法的探究
    4.4 CRISPR-CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在水稻中的應用
    4.5 耐冷候選基因OsRBCS3的功能驗證
    4.6 下一步的工作展望
第5章 結論
參考文獻
附錄 1 培養(yǎng)基及試劑的配制
附錄 2 CTAB法提取植物總DNA
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]基因組編輯技術在水稻功能基因組和遺傳改良中的應用[J]. 李希陶,劉耀光.  生命科學. 2016(10)
[2]功能性水稻研究思路和前景分析[J]. 陳浩.  生命科學. 2016(10)
[3]CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究進展及其在水稻上的應用[J]. 彭亞瓊,陳光輝,李懿星,李莉.  安徽農業(yè)科學. 2016(22)
[4]基于基因組編輯技術的水稻靶向突變特征及遺傳分析[J]. 唐麗,李曜魁,張丹,毛畢剛,呂啟明,胡遠藝,韶也,彭彥,趙炳然,夏石頭.  遺傳. 2016(08)
[5]基于CRISPR/Cas9技術的水稻千粒重基因tgw6突變體的創(chuàng)建[J]. 王加峰,鄭才敏,劉維,羅文龍,王慧,陳志強,郭濤.  作物學報. 2016(08)
[6]人工核酸酶介導的基因組編輯技術[J]. 支大龍,牛昱宇,季維智.  中國生物化學與分子生物學報. 2015(11)
[7]CRISPR/Cas技術研究進展[J]. 常振儀,嚴維,劉東風,陳竹鋒,謝剛,盧嘉威,吳建新,唐曉艷.  農業(yè)生物技術學報. 2015(09)
[8]CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組定點編輯中的研究進展[J]. 解莉楠,宋鳳艷,張旸.  中國農業(yè)科學. 2015(09)
[9]氣候平均值變化對遼寧水稻延遲型冷害評估結果的影響[J]. 紀瑞鵬,于文穎,武晉雯,馮銳,張玉書.  應用生態(tài)學報. 2015(06)
[10]CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻基因編輯中的應用研究進展[J]. 陳偉潘.  南方農業(yè). 2015(03)

博士論文
[1]CRISPR-Cas9介導的玉米基因組定點編輯研究[D]. 朱金潔.中國農業(yè)大學 2015
[2]水稻耐冷基因COR1的克隆與功能研究[D]. 黃李超.中國農業(yè)科學院 2015
[3]基于生物信息學方法的水稻TLP、SBP-box、CPP-like、Cystatin和HAK基因家族的分子進化研究[D]. 楊澤峰.揚州大學 2008

碩士論文
[1]水稻冷脅迫應答miR156k的克隆與耐冷功能分析[D]. 崔娜.東北農業(yè)大學 2016
[2]水稻抽穗基因Hd1的CRISPR/Cas9載體構建及結果分析[D]. 王蘭.四川農業(yè)大學 2015
[3]低溫脅迫下水稻幼苗蛋白表達研究[D]. 周萍.廣西大學 2013
[4]不同啟動子驅動Rc基因在轉基因水稻中表達的研究[D]. 楊晴晴.揚州大學 2013
[5]水稻穗長QTL定位[D]. 蔣強.重慶大學 2008
[6]水稻耐冷性遺傳基礎研究[D]. 樓巧君.華中農業(yè)大學 2006



本文編號：3688724