發(fā)布時間：2022-10-08 14:14

　　水稻的雜交育種耗時長、操作復(fù)雜,且難以達(dá)到性狀定向改良的目的。利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因的定點編輯已經(jīng)在水稻中得到了成功的運用。我們使用CRISPR/Cas9技術(shù)定向改良了水稻性狀,挑選wx、fgr、sd1、hd1、ghd7.1、GS3為候選靶基因,設(shè)計它們的CRISPR/Cas9編輯載體,通過農(nóng)桿菌侵染法構(gòu)建這些載體在不同水稻材料中的突變體。通過雜交或自交的方法,得到無T-DNA插入的水稻。此方法一方面可以快速定向改良水稻性狀,另一方面,也可以創(chuàng)建突變體,提供新型種質(zhì)資源。主要結(jié)果如下:1.根據(jù)候選基因設(shè)計靶點,將兩個候選基因的靶點同時構(gòu)建到CRISPR/Cas9編輯載體。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法分別獲得了華2613S-wx-fgr、貴州香禾糯-sd1-ghd7.12、貴州香禾糯-hd1-ghd7.11、香玉玻-GS3的T₀代轉(zhuǎn)基因植株。2.使用自交和雜交的方法獲得雙基因純合的功能突變型華2613S-wx1-fgr2、貴州香禾糯-sd1-ghd7.12、貴州香禾糯-hd1-ghd7.11植株。3.考察T1代貴州香禾糯-hd1-ghd7.11、T

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 前言
    1.1 目的基因研究背景
        1.1.1 Wx基因的研究背景
        1.1.2 fgr基因的研究背景
        1.1.3 SD1基因的研究背景
        1.1.4 抽穗期相關(guān)基因的研究背景
        1.1.5 GS3基因的研究背景
    1.2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)概述
        1.2.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的適應(yīng)免疫機制
        1.2.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)的分類
        1.2.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中的應(yīng)用
    1.3 本研究的目的意義
第一章 利用CRISPR/Cas9技術(shù)改良貴州香禾糯的株高和抽穗期
    2 材料與方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 供實驗用水稻
            2.1.2 菌株和質(zhì)粒
        2.2 實驗方法
            2.2.1 CRISPR敲除載體的構(gòu)建
            2.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻的遺傳轉(zhuǎn)化
            2.2.3 水稻米質(zhì)的測定方法
    3 結(jié)果與分析
        3.1 雙靶點CRISPR/Cas9載體構(gòu)建
            3.1.1 U6/U3-sgRNA載體的構(gòu)建
            3.1.2 sgRNA載體與pCXUN載體的連接
        3.2 CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因植株T_0代的獲取和陽性鑒定結(jié)果
            3.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化
            3.2.2 轉(zhuǎn)基因陽性單株的篩選
        3.3 CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因植株的突變類型
        3.4 貴州香禾糯突變體突變基因型功能分析
            3.4.1 sd1突變基因型功能分析
            3.4.2 Hd1突變基因型功能分析
            3.4.3 Ghd7.1突變基因型功能分析
        3.5 轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定
            3.5.1 貴州香禾糯突變體株高和抽穗期的表型鑒定
            3.5.2 貴州香禾糯突變體農(nóng)藝性狀表型考察
            3.5.3 貴州香禾糯突變體品質(zhì)性狀表型考察
第二章 利用CRISPR/Cas9技術(shù)將水稻不育系華2613S改為香糯型
    2 材料與方法
    3 結(jié)果與分析
        3.1 雙靶點CRISPR/Cas9載體構(gòu)建
        3.2 CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因植株T0代的獲取和陽性鑒定結(jié)果
        3.3 CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因植株的突變類型
        3.4 華 2613S突變體突變基因型功能分析
            3.4.1 wx突變基因型功能分析
            3.4.2 fgr突變基因型功能分析
        3.5 華 2613S突變體直鏈淀粉含量及香味性狀的表型鑒定
第三章 利用CRISPR/Cas9技術(shù)改良香玉玻粒型
    2 材料與方法
    3 結(jié)果與分析
        3.1 單靶點CRISPR/Cas9載體構(gòu)建
        3.2 CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因植株T0代的獲取和陽性鑒定結(jié)果
        3.3 CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因植株的突變類型
        3.4 香玉玻突變體GS3突變基因型功能分析
        3.5 香玉玻突變體粒長性狀考察結(jié)果
    4 討論
        4.1 sd1基因不同突變體與株高的關(guān)系
        4.2 Hd1基因與Ghd7.1基因?qū)Τ樗肫诘挠绊?br>        4.3 抽穗期與日照時間的探討
        4.4 貴州香禾糯突變體材料非目的性狀變異
        4.5 wx基因調(diào)控水稻籽粒的直鏈淀粉含量
        4.6 突變體材料的篩選
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄 1：本研究中所用引物
    附錄 2：部分實驗的詳細(xì)步驟
        Protocol 1: SSR技術(shù)路線
        Protocol 2: 載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化中各核心實驗步驟
        Protocol 3: 水稻粳稻遺傳轉(zhuǎn)化體系
        Protocol 4: 水稻秈稻遺傳轉(zhuǎn)化體系
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3687860