發(fā)布時(shí)間：2022-08-29 20:10

　　植物與植食性昆蟲長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過程中,逐漸形成了多種復(fù)雜但極精巧的防御反應(yīng),用以抵御昆蟲的為害。其中茉莉酸（jasmonic acid,JA）信號(hào)途徑和綠葉揮發(fā)性物質(zhì)途徑（green leaf volatiles,GLVs）是植物防御反應(yīng)的核心。丙二烯氧化物合酶（allene oxide synthase,AOS）與脂氫過氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase,HPL）可以催化相同底物分別生成JA與GLVs,AOS與HPL應(yīng)對(duì)不同昆蟲為害表現(xiàn)出很高的特異性,影響JA與GLVs的生成量,進(jìn)而決定植物防御反應(yīng)的特異性。但目前,有關(guān)AOS與HPL基因?qū)οx為害應(yīng)答機(jī)制的研究還未見報(bào)道。因此,本研究擬克隆水稻AOS及HPL基因的啟動(dòng)子,探究?jī)煞N啟動(dòng)子對(duì)刺吸式口器昆蟲褐飛虱與咀嚼式口器昆蟲二化螟的應(yīng)答模式,利用啟動(dòng)子5’端漸次缺失、GUS活性測(cè)定、GUS組織化學(xué)染色、啟動(dòng)子抗蟲活性測(cè)定等方法,鑒定AOS及HPL啟動(dòng)子中對(duì)褐飛虱與二化螟為害產(chǎn)生應(yīng)答的功能區(qū)域。從啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)層面解析AOS及HPL基因?qū)οx為害的應(yīng)答機(jī)制,揭示水稻對(duì)不同口器害蟲做出特異防御反應(yīng)的內(nèi)在原因。在此基礎(chǔ)上,用克隆... 

【文章頁數(shù)】：260 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 前言
        1.1 植物對(duì)昆蟲防御反應(yīng)的研究進(jìn)展
            1.1.1 植物對(duì)昆蟲防御反應(yīng)的類型
            1.1.2 引起植物抗蟲反應(yīng)的激發(fā)子
            1.1.3 植物對(duì)咀嚼式口器昆蟲防御反應(yīng)的機(jī)理
            1.1.4 植物對(duì)刺吸式口器昆蟲防御反應(yīng)的機(jī)理
            1.1.5 植物針對(duì)咀嚼式與刺吸式口器昆蟲防御反應(yīng)的差異
        1.2 水稻對(duì)昆蟲防御反應(yīng)的研究進(jìn)展
            1.2.1 水稻主要害蟲及其為害
            1.2.2 二化螟簡(jiǎn)介
            1.2.3 褐飛虱簡(jiǎn)介
            1.2.4 水稻對(duì)二化螟及褐飛虱防御反應(yīng)的研究進(jìn)展
        1.3 丙二烯氧化物合酶及脂氫過氧化物裂解酶的研究進(jìn)展
            1.3.1 植物丙二烯氧化物合酶的研究進(jìn)展
            1.3.2 水稻丙二烯氧化物合酶的研究進(jìn)展
            1.3.3 植物脂氫過氧化物裂解酶的研究進(jìn)展
            1.3.4 水稻脂氫過氧化物裂解酶的研究進(jìn)展
        1.4 啟動(dòng)子的概述
            1.4.1 原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與功能
            1.4.2 真核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與功能
        1.5 植物啟動(dòng)子的類型
            1.5.1 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子
            1.5.2 組成型啟動(dòng)子
            1.5.3 組織特異型啟動(dòng)子
            1.5.4 人工合成啟動(dòng)子
        1.6 啟動(dòng)子研究常用方法與技術(shù)
            1.6.1 啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析
            1.6.2 候選基因表達(dá)模式檢測(cè)
            1.6.3 啟動(dòng)子的分離
            1.6.4 啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度的定量及定性分析
            1.6.5 啟動(dòng)子順式元件及反式作用因子鑒定分析
        1.7 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子分析在植物抗蟲機(jī)理研究中的作用
        1.8 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子分析在植物抗蟲應(yīng)用研究中的作用
    2 目的意義及創(chuàng)新點(diǎn)
        2.1 目的意義
        2.2 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)
第二章 水稻中昆蟲誘導(dǎo)型啟動(dòng)子克隆及功能分析
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 水稻材料
        1.2 供試?yán)ハx
        1.3 菌株及質(zhì)粒
        1.4 酶及化學(xué)試劑
        1.5 主要常用儀器
        1.6 序列分析
        1.7 候選基因信息
            1.7.1 OsHPL2候選基因信息
            1.7.2 OsAOS1候選基因信息
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 驗(yàn)證候選基因
            2.1.1 水稻接蟲及激素處理
            2.1.2 水稻葉鞘組織RNA抽提及反轉(zhuǎn)錄
            2.1.3 Os HPL2及Os AOS1 候選基因表達(dá)量檢測(cè)
        2.2 啟動(dòng)子的克隆、載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
            2.2.1 啟動(dòng)子序列分析
            2.2.2 全長(zhǎng)及系列5’端缺失啟動(dòng)子的克隆及載體構(gòu)建
            2.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化
        2.3 轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)
            2.3.1 轉(zhuǎn)基因植株陽性檢測(cè)
            2.3.2 轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)檢測(cè)
            2.3.3 轉(zhuǎn)基因植株純合家系檢測(cè)
        2.4 GUS組織化學(xué)染色
        2.5 GUS活性定量測(cè)定
            2.5.1 所用試劑配制
            2.5.2 總蛋白的抽提
            2.5.3 總蛋白濃度測(cè)定
            2.5.4 GUS活性測(cè)定
        2.6 二化螟為害正調(diào)控序列驅(qū)動(dòng)cry1C基因功能驗(yàn)證
            2.6.1 二化螟為害正調(diào)控序列啟動(dòng)子載體構(gòu)建
            2.6.2 Cry1C的 ELISA檢測(cè)
            2.6.3 二化螟初孵幼蟲死亡率檢測(cè)
        2.7 P2、P2R123-min35S、P2TR2-min35S轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀考查
        2.8 褐飛虱為害正調(diào)控序列缺失突變體啟動(dòng)子構(gòu)建
        2.9 酵母單雜交篩選互作蛋白
        2.10 互作蛋白EGY48酵母菌株“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)”驗(yàn)證
        2.11 水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化
        2.12 雙熒光素酶激活實(shí)驗(yàn)
        2.13 P_(AOS1)中與正調(diào)控序列互作蛋白的表達(dá)模式
    3 結(jié)果與分析
        3.1 水稻中二化螟為害誘導(dǎo)啟動(dòng)子P_(HPL2)的克隆及功能分析
            3.1.1 二化螟為害誘導(dǎo)候選基因的表達(dá)檢測(cè)
            3.1.2 激素和機(jī)械損傷處理下OsHPL2表達(dá)檢測(cè)
            3.1.3 P_(HPL2)轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)及純合家系檢測(cè)
            3.1.4 P_(HPL2) 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下,GUS的表達(dá)特性
            3.1.5 P_(HPL2)系列缺失啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)及純合家系檢測(cè)
            3.1.6 P_(HPL2)系列缺失啟動(dòng)子組織化學(xué)染色分析
            3.1.7 P_(HPL2)及其系列缺失啟動(dòng)子GUS活性定量測(cè)定
            3.1.8 P-1452、P-903和P-376對(duì)褐飛虱為害的反應(yīng)
            3.1.9 二化螟為害誘導(dǎo)正調(diào)控序列中潛在順式元件分析
            3.1.10 二化螟幼蟲為害不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)cry1C轉(zhuǎn)基因水稻的死亡率
            3.1.11 二化螟幼蟲為害后,不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)cry1C轉(zhuǎn)基因水稻中Cry1C蛋白含量ELISA檢測(cè)
            3.1.12 不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)cry1C轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)激素和機(jī)械損傷的反應(yīng)
            3.1.13 轉(zhuǎn)基因植株田間農(nóng)藝性狀考查
        3.2 水稻中褐飛虱為害誘導(dǎo)啟動(dòng)子P_(AOS1)的克隆及功能分析
            3.2.1 褐飛虱為害誘導(dǎo)候選基因的表達(dá)檢測(cè)
            3.2.2 激素和機(jī)械損傷處理下OsAOS1表達(dá)檢測(cè)
            3.2.3 P_(AOS1)轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)及純合家系檢測(cè)
            3.2.4 P_(AOS1)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下,GUS的表達(dá)特性
            3.2.5 P_(AOS1)系列缺失啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)及純合家系檢測(cè)
            3.2.6 P_(AOS1)系列缺失啟動(dòng)子組織化學(xué)染色分析
            3.2.7 P_(AOS1)及其系列缺失啟動(dòng)子GUS活性定量測(cè)定
            3.2.8 P-1573、P-979和P-426對(duì)二化螟為害的反應(yīng)
            3.2.9 褐飛虱為害誘導(dǎo)正調(diào)控序列中潛在順式元件分析
            3.2.10 正調(diào)控序列缺失突變體啟動(dòng)子GUS活性定量測(cè)定
            3.2.11 篩選與褐飛虱為害誘導(dǎo)正調(diào)控序列互作的蛋白
            3.2.12 酵母單雜交驗(yàn)證候選蛋白
            3.2.13 互作蛋白的雙熒光素酶激活驗(yàn)證
            3.2.14 互作蛋白受褐飛虱與二化螟為害后表達(dá)檢測(cè)
    4 討論
        4.1 二化螟與褐飛虱接蟲實(shí)驗(yàn)方法探討
        4.2 二化螟為害誘導(dǎo)正調(diào)控區(qū)域用于轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的潛力
        4.3 P_(HPL2)和P_(AOS1)可能的誘導(dǎo)表達(dá)模式
        4.4 P_(HPL2)和P_(AOS1)中順式元件分析
        4.5 P_(AOS1)啟動(dòng)子上的結(jié)合蛋白
        4.6 昆蟲為害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子研究展望
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄 Ⅰ:部分實(shí)驗(yàn)操作步驟
    附錄 Ⅱ:部分實(shí)驗(yàn)圖
    附錄 Ⅲ:核苷酸序列
    附錄 Ⅳ:水稻受二化螟與褐飛虱為害的轉(zhuǎn)錄組分析
    附錄 Ⅴ:作者簡(jiǎn)介
致謝



本文編號(hào)：3678935