植物與植食性昆蟲長期協(xié)同進化過程中,逐漸形成了多種復雜但極精巧的防御反應,用以抵御昆蟲的為害。其中茉莉酸（jasmonic acid,JA）信號途徑和綠葉揮發(fā)性物質途徑（green leaf volatiles,GLVs）是植物防御反應的核心。丙二烯氧化物合酶（allene oxide synthase,AOS）與脂氫過氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase,HPL）可以催化相同底物分別生成JA與GLVs,AOS與HPL應對不同昆蟲為害表現(xiàn)出很高的特異性,影響JA與GLVs的生成量,進而決定植物防御反應的特異性。但目前,有關AOS與HPL基因對害蟲為害應答機制的研究還未見報道。因此,本研究擬克隆水稻AOS及HPL基因的啟動子,探究兩種啟動子對刺吸式口器昆蟲褐飛虱與咀嚼式口器昆蟲二化螟的應答模式,利用啟動子5’端漸次缺失、GUS活性測定、GUS組織化學染色、啟動子抗蟲活性測定等方法,鑒定AOS及HPL啟動子中對褐飛虱與二化螟為害產生應答的功能區(qū)域。從啟動子結構層面解析AOS及HPL基因對害蟲為害的應答機制,揭示水稻對不同口器害蟲做出特異防御反應的內在原因。在此基礎上,用克隆... 

【文章頁數(shù)】：260 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1 前言
        1.1 植物對昆蟲防御反應的研究進展
            1.1.1 植物對昆蟲防御反應的類型
            1.1.2 引起植物抗蟲反應的激發(fā)子
            1.1.3 植物對咀嚼式口器昆蟲防御反應的機理
            1.1.4 植物對刺吸式口器昆蟲防御反應的機理
            1.1.5 植物針對咀嚼式與刺吸式口器昆蟲防御反應的差異
        1.2 水稻對昆蟲防御反應的研究進展
            1.2.1 水稻主要害蟲及其為害
            1.2.2 二化螟簡介
            1.2.3 褐飛虱簡介
            1.2.4 水稻對二化螟及褐飛虱防御反應的研究進展
        1.3 丙二烯氧化物合酶及脂氫過氧化物裂解酶的研究進展
            1.3.1 植物丙二烯氧化物合酶的研究進展
            1.3.2 水稻丙二烯氧化物合酶的研究進展
            1.3.3 植物脂氫過氧化物裂解酶的研究進展
            1.3.4 水稻脂氫過氧化物裂解酶的研究進展
        1.4 啟動子的概述
            1.4.1 原核生物啟動子的結構與功能
            1.4.2 真核生物啟動子的結構與功能
        1.5 植物啟動子的類型
            1.5.1 誘導型啟動子
            1.5.2 組成型啟動子
            1.5.3 組織特異型啟動子
            1.5.4 人工合成啟動子
        1.6 啟動子研究常用方法與技術
            1.6.1 啟動子生物信息學分析
            1.6.2 候選基因表達模式檢測
            1.6.3 啟動子的分離
            1.6.4 啟動子表達強度的定量及定性分析
            1.6.5 啟動子順式元件及反式作用因子鑒定分析
        1.7 誘導型啟動子分析在植物抗蟲機理研究中的作用
        1.8 誘導型啟動子分析在植物抗蟲應用研究中的作用
    2 目的意義及創(chuàng)新點
        2.1 目的意義
        2.2 本研究的創(chuàng)新點
第二章 水稻中昆蟲誘導型啟動子克隆及功能分析
    1 試驗材料
        1.1 水稻材料
        1.2 供試昆蟲
        1.3 菌株及質粒
        1.4 酶及化學試劑
        1.5 主要常用儀器
        1.6 序列分析
        1.7 候選基因信息
            1.7.1 OsHPL2候選基因信息
            1.7.2 OsAOS1候選基因信息
    2 試驗方法
        2.1 驗證候選基因
            2.1.1 水稻接蟲及激素處理
            2.1.2 水稻葉鞘組織RNA抽提及反轉錄
            2.1.3 Os HPL2及Os AOS1 候選基因表達量檢測
        2.2 啟動子的克隆、載體構建及遺傳轉化
            2.2.1 啟動子序列分析
            2.2.2 全長及系列5’端缺失啟動子的克隆及載體構建
            2.2.3 農桿菌介導的水稻遺傳轉化
        2.3 轉基因植株檢測
            2.3.1 轉基因植株陽性檢測
            2.3.2 轉基因植株拷貝數(shù)檢測
            2.3.3 轉基因植株純合家系檢測
        2.4 GUS組織化學染色
        2.5 GUS活性定量測定
            2.5.1 所用試劑配制
            2.5.2 總蛋白的抽提
            2.5.3 總蛋白濃度測定
            2.5.4 GUS活性測定
        2.6 二化螟為害正調控序列驅動cry1C基因功能驗證
            2.6.1 二化螟為害正調控序列啟動子載體構建
            2.6.2 Cry1C的 ELISA檢測
            2.6.3 二化螟初孵幼蟲死亡率檢測
        2.7 P2、P2R123-min35S、P2TR2-min35S轉基因植株農藝性狀考查
        2.8 褐飛虱為害正調控序列缺失突變體啟動子構建
        2.9 酵母單雜交篩選互作蛋白
        2.10 互作蛋白EGY48酵母菌株“點對點”驗證
        2.11 水稻原生質體瞬時轉化
        2.12 雙熒光素酶激活實驗
        2.13 P_(AOS1)中與正調控序列互作蛋白的表達模式
    3 結果與分析
        3.1 水稻中二化螟為害誘導啟動子P_(HPL2)的克隆及功能分析
            3.1.1 二化螟為害誘導候選基因的表達檢測
            3.1.2 激素和機械損傷處理下OsHPL2表達檢測
            3.1.3 P_(HPL2)轉基因植株拷貝數(shù)及純合家系檢測
            3.1.4 P_(HPL2) 啟動子驅動下,GUS的表達特性
            3.1.5 P_(HPL2)系列缺失啟動子轉基因植株拷貝數(shù)及純合家系檢測
            3.1.6 P_(HPL2)系列缺失啟動子組織化學染色分析
            3.1.7 P_(HPL2)及其系列缺失啟動子GUS活性定量測定
            3.1.8 P-1452、P-903和P-376對褐飛虱為害的反應
            3.1.9 二化螟為害誘導正調控序列中潛在順式元件分析
            3.1.10 二化螟幼蟲為害不同啟動子驅動cry1C轉基因水稻的死亡率
            3.1.11 二化螟幼蟲為害后,不同啟動子驅動cry1C轉基因水稻中Cry1C蛋白含量ELISA檢測
            3.1.12 不同啟動子驅動cry1C轉基因水稻對激素和機械損傷的反應
            3.1.13 轉基因植株田間農藝性狀考查
        3.2 水稻中褐飛虱為害誘導啟動子P_(AOS1)的克隆及功能分析
            3.2.1 褐飛虱為害誘導候選基因的表達檢測
            3.2.2 激素和機械損傷處理下OsAOS1表達檢測
            3.2.3 P_(AOS1)轉基因植株拷貝數(shù)及純合家系檢測
            3.2.4 P_(AOS1)啟動子驅動下,GUS的表達特性
            3.2.5 P_(AOS1)系列缺失啟動子轉基因植株拷貝數(shù)及純合家系檢測
            3.2.6 P_(AOS1)系列缺失啟動子組織化學染色分析
            3.2.7 P_(AOS1)及其系列缺失啟動子GUS活性定量測定
            3.2.8 P-1573、P-979和P-426對二化螟為害的反應
            3.2.9 褐飛虱為害誘導正調控序列中潛在順式元件分析
            3.2.10 正調控序列缺失突變體啟動子GUS活性定量測定
            3.2.11 篩選與褐飛虱為害誘導正調控序列互作的蛋白
            3.2.12 酵母單雜交驗證候選蛋白
            3.2.13 互作蛋白的雙熒光素酶激活驗證
            3.2.14 互作蛋白受褐飛虱與二化螟為害后表達檢測
    4 討論
        4.1 二化螟與褐飛虱接蟲實驗方法探討
        4.2 二化螟為害誘導正調控區(qū)域用于轉基因抗蟲水稻的潛力
        4.3 P_(HPL2)和P_(AOS1)可能的誘導表達模式
        4.4 P_(HPL2)和P_(AOS1)中順式元件分析
        4.5 P_(AOS1)啟動子上的結合蛋白
        4.6 昆蟲為害誘導型啟動子研究展望
參考文獻
附錄
    附錄 Ⅰ:部分實驗操作步驟
    附錄 Ⅱ:部分實驗圖
    附錄 Ⅲ:核苷酸序列
    附錄 Ⅳ:水稻受二化螟與褐飛虱為害的轉錄組分析
    附錄 Ⅴ:作者簡介
致謝



本文編號：3678935