植物發(fā)育的最后一個(gè)階段是葉片的衰老,葉衰老的過程中資源降解后轉(zhuǎn)移到新器官以維持生長,通過延緩衰老可以延長植物的生育期。在前期的研究中,將酸性磷酸酶活性基因ZmAPRG定位在546kb的目標(biāo)區(qū)段,在這個(gè)區(qū)段內(nèi),包括5個(gè)具有功能注釋的基因,其中發(fā)現(xiàn)有ZmVQ52基因在兩個(gè)親本082和107中CDS序列無差異,而啟動(dòng)子存在差異。因此,本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)ZmVQ52基因來進(jìn)行研究,用CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)ZmVQ52的過表達(dá),獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥以便后續(xù)的研究。本研究中,從玉米自交系B73中克隆獲得ZmVQ52基因,對(duì)其進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析,蛋白功能定位,互作蛋白分析,轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型鑒定,激素處理,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和差異表達(dá)基因定量驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)在玉米衰老調(diào)節(jié)機(jī)制中ZmVQ52基因扮演著重要的角色。本研究的主要結(jié)果如下:（1）ZmVQ52基因開放閱讀框（ORF）全長為576bp,編碼191個(gè)氨基酸,該基因克隆后構(gòu)建CaMV-ZmVQ52植物雙源表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥株系,用潮霉素抗性篩選,PCR檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系OE4和OE5;（2）取玉米自交系成熟期的五個(gè)組... 

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【圖文】：

ZmVQ52基因克隆Figure4.1CloningofZmVQ52

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文42應(yīng)答元件數(shù)量光響應(yīng)GBox（3個(gè)），GT1motif（1個(gè)）茉莉酸甲酯響應(yīng)（ME-JA）CGTCAmotif（4個(gè)），TGACGmotif（4個(gè)）脫落酸響應(yīng)（ABA）ABRE（3個(gè)）4.2ZmVQ52基因的組織特異性表達(dá)分析為了分析ZmVQ52基因的表達(dá)模式，本實(shí)驗(yàn)選取了玉米自交系B73成熟期的根、莖、葉、雌穗和雄穗，通過qRT-PCR的實(shí)驗(yàn)方法，分析發(fā)現(xiàn)ZmVQ52基因在葉片中的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量最高，雌穗和雄穗次之，根、莖中表達(dá)量最低，表明該基因主要在玉米葉片中表達(dá)（如圖4.2所示）。ZmVQ52基因在各個(gè)組織中的轉(zhuǎn)錄水平不同，意味著ZmVQ52基因可能在某些特定的組織發(fā)揮著重要的功能。圖4.2ZmVQ52基因在玉米自交系B73不同組織中的表達(dá)模式Figure4.2ExpressionpatternofZmVQ52invarioustissuesofmaizeB73inbred利用qRT-PCR的實(shí)驗(yàn)方法來鑒定ZmVQ52基因的表達(dá)水平。其中，以ZmActin3作為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)通過2-CT方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)數(shù)值都是三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值TheexpressionlevelofZmVQ52genewasdeterminedbyqRT-PCR.Amongthem,ZmActin3isusedastheinternalreferencegene.DatafromqRT-PCRexperimentswereanalyzedaccordingtothe2-CTmethod.Eachvalueistheaverageofthreebiologicalreplicates.4.3ZmVQ52基因的亞細(xì)胞定位結(jié)果分析在本研究中，采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒ZmVQ52-GFP轉(zhuǎn)化事先提取的玉米原生質(zhì)體，在共聚焦顯微鏡中觀察熒光信號(hào)，確定ZmVQ52的細(xì)胞定位。結(jié)果如圖所示（圖4.3），對(duì)照組在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都能看到GFP熒光信號(hào)，而ZmVQ52-GFP融合蛋白只在細(xì)胞核中能看到明顯的熒光信號(hào)。上述結(jié)果表明，

4結(jié)果與分析43ZmVQ52蛋白定位于細(xì)胞核，在細(xì)胞中作為一個(gè)核蛋白發(fā)揮作用。圖4.3ZmVQ52-GFP融合蛋白在玉米原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位Figure4.3SubcellularlocalizationofZmVQ52-GFPfusionproteininmaizeprotoplastsA：GFP蛋白在細(xì)胞中的熒光信號(hào)，作為空白對(duì)照；B：ZmVQ52-GFP融合蛋白在玉米原生質(zhì)體中的表達(dá)情況。各列分別表示GFP熒光信號(hào)，紅光信號(hào)，明場(chǎng)圖片和融合圖片。標(biāo)尺=10μm。A：FluorescentsignalofGFPproteinincellwasusedasacontrol；B:ZmVQ52-GFPfusionproteinwasexpressedinmaizeprotoplasts.TheGFPfluorescence,mCherry,ESIDimageandMergedimageofGFP,mCherry,ESIDimagesareshownintherespectivepanels.Bars=10μm.4.4ZmVQ52基因與WRKY轉(zhuǎn)錄因子的互作篩選本研究中，將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒ZmVQ52-pDOE-03-WRKY與核Marker質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體，在共聚焦顯微鏡中拍照觀察，結(jié)果如圖所示（圖4.4）。ZmVQ52-pDOE-03載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后作為空白對(duì)照，ZmVQ52-pDOE-03-ZmWRKY42載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后沒有在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)，以此作為陰性對(duì)照。ZmWRKY20、ZmWRKY36、ZmWRKY50和ZmWRKY71分別與ZmVQ52構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后在細(xì)胞核中存在熒光信號(hào)。上述的結(jié)果表明ZmWRKY20、ZmWRKY36、ZmWRKY50和ZmWRKY71分別與ZmVQ52共定位于細(xì)胞核，即這四個(gè)蛋白與ZmVQ52存在相互作用并在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。AB

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]水稻OsFWL家族部分基因的生物學(xué)功能研究[D]. 熊文濤.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3589021