一、TALENs與CRISPR/Cas9介導(dǎo)的大豆基因定點(diǎn)編輯大豆[Glycine Max（L.）Merr.]起源于中國,是重要的油料和高蛋白作物,含有多種對(duì)人類有益的生理活性物質(zhì),如異黃酮等,此外大豆也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)體系中重要的養(yǎng)地作物（能固氮,對(duì)化肥需求較少）�；蚪M定點(diǎn)編輯技術(shù)（或稱基因打靶技術(shù)）是對(duì)基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行操作,誘發(fā)該位點(diǎn)DNA序列的改變,如堿基的插入缺失、基因的插入或替換以及大片段DNA的缺失等。目前應(yīng)用比較廣泛的是轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription Activator-like Effectors Nucleases,TALENs）和 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated（Cas）9技術(shù)�；蚪M定點(diǎn)編輯技術(shù)依賴于轉(zhuǎn)基因技術(shù),但基因編輯后的生物可以不含任何新引入的遺傳物質(zhì)或外源DNA,是一種“非轉(zhuǎn)基因的遺傳修飾”。相比于傳統(tǒng)育種技術(shù)的周期長、效率低的缺點(diǎn),以及轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)中引入外源DNA的生物安全問題,基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)在... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：161 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖１－１人工設(shè)計(jì)的核酸酶編輯基因組的修復(fù)結(jié)果（Ｋｉｍ?ａｎｄ?Ｋｉｍ?２０１４）??Ｆｉｇ．?１－１?Ｏｕｔｃｏｍｅ?ｏｆ?ｇｅｎｏｍｅ?ｅｄｉｔｉｎｇ?ｕｓｉｎｇ?ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ?ｎｕｃｌｅａｓｅｓ??

ｒｅｐｅａｔｓ?（ＣＲＩＳＰＲ）?／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?（Ｃａｓ）?９。ＺＦＮｓ、ＴＡＬＥＮｓ?和?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ是研究比較多的，現(xiàn)在普遍采用的是后兩種技術(shù)，特別是ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術(shù)。??Ｕ歸巢核酸內(nèi)切酶??歸巢核酸內(nèi)切酶（ＨｏｍｉｎｇＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）是最早用于基因打粑的工具酶，能夠別長度為１４？４０ｂｐ的核甘酸序列，故又名大范圍核酸酶（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ）?（Ｓｔｏｄｄａ２０１１；?Ｂｅｌｆｏｒｔ?ａｎｄ?Ｂｏｎｏｃｏｒａ?２０１４）。歸巢核酸內(nèi)切酶是由嵌入在內(nèi)含子（ｇｒｏｕｐ?Ｉ、ｇｒｏｕＩＩ和ａｒｃｈａｅｌ類內(nèi)含子）里的ＯＲＦ編碼，或者是由內(nèi)含肽切割產(chǎn)生的內(nèi)切酶，能夠使內(nèi)含子在ＤＮＡ水平上的移動(dòng)。歸巢核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列被稱為歸巢位點(diǎn)，由含子間或內(nèi)含子側(cè)翼的ＤＮＡ片段組成，內(nèi)切酶識(shí)別并切割同源等位基因中非內(nèi)含區(qū)域的歸巢位點(diǎn)，然后利用修復(fù)機(jī)制插入內(nèi)含子（Ｓｔｏｄｄａｒｄ２００５）。目前ＬＡＧＬＩＤＡＤ歸巢核酸酶家族在基因打靶中使用最多，其包含一個(gè)或兩個(gè)ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ片段的貝。含有兩個(gè)ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ片段拷貝的酶被１００個(gè)左右氨基酸殘基分隔開，以單的形式發(fā)揮作用，如Ｉ－Ｄｍｏｌ和Ｉ－Ｓｃｅｌ等；只有一個(gè)ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ片段拷貝的酶可形成同型二聚體后識(shí)別具有回文結(jié)構(gòu)的歸巢位點(diǎn)，包括Ｉ－Ｃｒｅｌ和Ｉ－ＣｅｕＩ等（圖１－２）Ｉｎｒｎａｌｌｓｍｍｅｒｉｃｍｏｎｏｍｅｒ??

２個(gè)互補(bǔ)的ＺＦＮｓ在靶位點(diǎn)分別通過鋅指結(jié)構(gòu)以尾對(duì)尾的方式識(shí)別５’一３＇和３＇—５’的??ＤＮＡ鏈，然后２個(gè)ＦｏｋＩ核酸酶形成二聚體，激活內(nèi)切酶活性來切割靶位點(diǎn)，產(chǎn)生雙??鏈缺口（ＤＳＢｓ），從而誘發(fā)ＤＮＡ損傷修復(fù)機(jī)制（圖１－３）。２個(gè)ＺＦＮ就可以在基因??組中特異性地結(jié)合１８？２４ｂｐ長度的序列。目前識(shí)別每一種三聯(lián)堿基的６４種鋅指組合??中己有大部分被發(fā)現(xiàn)并編撰成目錄。針對(duì)每一條需要識(shí)別的目標(biāo)序列（打靶位點(diǎn)），??我們都可以使用與密碼子對(duì)應(yīng)的類似方式對(duì)鋅指結(jié)構(gòu)進(jìn)行模塊化組裝（ｍｏｄｕｌａｒ??ａｓｓｅｍｂｌｙ），從而獲得能夠識(shí)另Ｕ特定ＤＮＡ序歹Ｕ的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)。??（Ｑ?１?Ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ?ｍｏｔｉｆ?ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ?Ｉ?ｈ??Ｋ?｝?ＣＸ“ＣＸ，ＦＩＸ，ＨＸ，Ｈ?Ｕ??；；Ｒｉｇｈｔ?ＺＦＰ?（??ｌｅｆｔ?ＺＦＰ??圖１－３鋅指核酸酶設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)示意圖（Ｋｉｍ?ａｎｄ?Ｋｉｍ?２０１４）??Ｆｉｇ．?１－３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｄｅｓｉｇｎｅｄ?ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ??（ａ）鋅指的原理示意圖；（ｂ）鋅指結(jié)合ＤＮＡ的計(jì)算機(jī)模型。??（ａ）?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ?ｏｆ?ａ?ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ?ｎｕｃｌｅａｓｅ?（ＺＦＮ）?ｐａｉｒ；?（ｂ）?Ｃｏｍｐｕｔｅｒ?ｍｏｄｅｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ａ?ＺＦＮ?ｐａｉｒ??ｂｏｕｎｄ?ｔｏ?ＤＮＡ．??第一個(gè)鋅指核酸酶是由約翰霍普金斯大學(xué)Ｃｈａｎｄｒａ實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)（Ｋｉｍ?ｅｔ?ａｌ．?１９９６），??該酶使用３個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域連接一個(gè)Ｆｏｋ?Ｉ核酸酶的催化活性功能域

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3583590