轉基因玉米中外源基因整合位點分析及籽粒敗育的初步研究
發(fā)布時間：2022-01-09 01:33
玉米（Zea mays L.）作為我國重要的糧食作物之一,在我國的農業(yè)和工業(yè)生產中起著重要作用。玉米螟等害蟲嚴重危害玉米生產,每年導致約10%的玉米產量損失�？瓜x轉基因玉米的廣泛應用可以有效防治玉米蟲害,降低玉米產量損失,并減少農藥使用量。研發(fā)有應用價值的轉基因玉米事件,需要明確外源基因在受體基因組中的整合位點,而且外源基因的整合不能對玉米生產性狀產生不利影響。本研究所用的抗蟲轉基因玉米IE034由本實驗室創(chuàng)制,前期研究表明該轉化事件的外源基因有一個拷貝,并且室內和田間均高抗玉米螟。但是,在研究過程中發(fā)現(xiàn)此轉基因玉米事件出現(xiàn)籽粒敗育的現(xiàn)象。本文首先運用TAIL-PCR分離抗蟲轉基因玉米IE034的側翼序列,通過構建Fosmid基因組文庫和遺傳定位的方法對外源基因的整合位點進行了研究,并對該轉基因玉米出現(xiàn)的籽粒敗育表型進行了分析。主要研究結果如下:1、通過TAIL-PCR分離出IE034中外源基因插入位置上游旁側序列,發(fā)現(xiàn)外源基因插入到了玉米基因組的重復序列區(qū),并且外源基因在插入玉米基因組中的過程中進行了復雜的整合,部分骨架載體整合到玉米基因組中。2、提取轉基因玉米的基因組DNA,構建F...
【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市
【文章頁數(shù)】：53 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
996年～2016年全球轉基因作物種植面積(James,2016)
中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言序列 (Liu et al, 1995a)。TAIL-PCR 是利用幾個嵌套的已知序列的特異性引物依次與退火溫度較低的簡并引物 (Arbitrary Degenerate Primer，AD Primer) 組合。特異性的引物的退火溫度較高，一般在 60℃左右；簡并引物的退火溫度較低，在 45℃左右。然后依據引物的差異設計不對稱的溫度循環(huán)，再經過巢式反應特異性的引物優(yōu)先進行擴增，得到特異性的擴增產物。TAIL-PCR 反應步驟如圖 1.2 所示：第一次 PCR 反應包括 5 次高特異性反應、1 次低特異性反應、10 次較低特異性的反應和 12 次熱不對稱的的超級循環(huán)。然后將第一次反應的產物作為模板以特異引物 SP2 和同一簡并引物進行熱不對稱超級循環(huán)，使特異性產物被選擇性的擴增。第三次反應是將第二次反應產物作為模板，以 SP3 和同一引物 AD 作為引物進行普通的擴增，最后通過瓊脂糖凝膠電泳分離出已知序列鄰近的目標序列。
學院碩士學位論文 進行了改進，改進后的擴增成功率高于 90%，大部分情況下獲得的IL-PCR 還被應用于分離 T-DNA 插入構建的突變體庫的側翼序列。R分離T-DNA插入突變體的側翼序列鑒定出潛在參與纖維素酶和半 年 Fujimoto 等通過 TAIL-PCR 的方法對 T-DNA 進行定位來研究染向 PCR 技術man 等 (1988) 提出依據常規(guī)的聚合酶鏈式反應 (PCR) 技術，通過列的方法。其原理是用已知序列選擇合適的限制性內切酶消化轉化進行自身環(huán)化后作為模板，在已知序列兩端設計特異性引物，經過列 (圖 1.3)。反向 PCR 技術成功克隆出側翼序列后 (Triglia et al.,19
【參考文獻】：
期刊論文
[1]棉花單核苷酸多態(tài)性標記研究進展[J]. 王振玉,李威,周曉箭,裴小雨,劉艷改,周克海,張文生,孟清芹,王海風,葛勇,李瑩,劉俊芳,馬雄風,楊代剛. 棉花學報. 2016(04)
[2]Fosmid library construction and screening for the maize mutant gene Vestigial glume 1[J]. Chaoxian Liu,Xiaoli Liu,Lei Lei,Haiying Guan,Yilin Cai. The Crop Journal. 2016(01)
[3]玉米基因組Fosmid文庫構建及類受體激酶基因（Psy1和Psy2）篩選[J]. 吳曉軍,徐麗,王守才. 農業(yè)生物技術學報. 2014(10)
[4]轉基因水稻EB7001S事件特異性檢測方法的建立[J]. 魏歲軍,鄧力華,肖國櫻. 農業(yè)生物技術學報. 2014(05)
[5]植物轉基因技術研究進展[J]. 駱翔,劉志頤,章樹民,申碩,王德福,王勁松. 中國農學通報. 2014(15)
[6]一個玉米旱敏感突變體的遺傳分析與基因定位[J]. 牟穎熙,劉艷,王國英,鄭軍. 植物遺傳資源學報. 2014(03)
[7]Panhandle PCR strategy to amplify the upstream unknown sequence of the Pr1 gene of pythium guiyangense[J]. DUAN Siliang,SU Xiaoqing,YU Sheng. Journal of Medical Colleges of PLA. 2013(05)
[8]圖位克隆技術在玉米基因分離中的應用[J]. 呂洪坤,鄭軍. 分子植物育種. 2013(03)
[9]轉基因抗蟲玉米環(huán)境安全性及我國應用前景[J]. 李寧,何康來,崔蕾,王振營. 植物保護. 2011(06)
[10]擴增T-DNA插入位點側翼序列的方法及其應用進展[J]. 祁洋,李燕,王永智,尉亞輝. 安徽農業(yè)科學. 2009(17)
本文編號：3577676
【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市
【文章頁數(shù)】：53 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
996年～2016年全球轉基因作物種植面積(James,2016)
中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言序列 (Liu et al, 1995a)。TAIL-PCR 是利用幾個嵌套的已知序列的特異性引物依次與退火溫度較低的簡并引物 (Arbitrary Degenerate Primer，AD Primer) 組合。特異性的引物的退火溫度較高，一般在 60℃左右；簡并引物的退火溫度較低，在 45℃左右。然后依據引物的差異設計不對稱的溫度循環(huán)，再經過巢式反應特異性的引物優(yōu)先進行擴增，得到特異性的擴增產物。TAIL-PCR 反應步驟如圖 1.2 所示：第一次 PCR 反應包括 5 次高特異性反應、1 次低特異性反應、10 次較低特異性的反應和 12 次熱不對稱的的超級循環(huán)。然后將第一次反應的產物作為模板以特異引物 SP2 和同一簡并引物進行熱不對稱超級循環(huán)，使特異性產物被選擇性的擴增。第三次反應是將第二次反應產物作為模板，以 SP3 和同一引物 AD 作為引物進行普通的擴增，最后通過瓊脂糖凝膠電泳分離出已知序列鄰近的目標序列。
學院碩士學位論文 進行了改進，改進后的擴增成功率高于 90%，大部分情況下獲得的IL-PCR 還被應用于分離 T-DNA 插入構建的突變體庫的側翼序列。R分離T-DNA插入突變體的側翼序列鑒定出潛在參與纖維素酶和半 年 Fujimoto 等通過 TAIL-PCR 的方法對 T-DNA 進行定位來研究染向 PCR 技術man 等 (1988) 提出依據常規(guī)的聚合酶鏈式反應 (PCR) 技術，通過列的方法。其原理是用已知序列選擇合適的限制性內切酶消化轉化進行自身環(huán)化后作為模板，在已知序列兩端設計特異性引物，經過列 (圖 1.3)。反向 PCR 技術成功克隆出側翼序列后 (Triglia et al.,19
【參考文獻】：
期刊論文
[1]棉花單核苷酸多態(tài)性標記研究進展[J]. 王振玉,李威,周曉箭,裴小雨,劉艷改,周克海,張文生,孟清芹,王海風,葛勇,李瑩,劉俊芳,馬雄風,楊代剛. 棉花學報. 2016(04)
[2]Fosmid library construction and screening for the maize mutant gene Vestigial glume 1[J]. Chaoxian Liu,Xiaoli Liu,Lei Lei,Haiying Guan,Yilin Cai. The Crop Journal. 2016(01)
[3]玉米基因組Fosmid文庫構建及類受體激酶基因（Psy1和Psy2）篩選[J]. 吳曉軍,徐麗,王守才. 農業(yè)生物技術學報. 2014(10)
[4]轉基因水稻EB7001S事件特異性檢測方法的建立[J]. 魏歲軍,鄧力華,肖國櫻. 農業(yè)生物技術學報. 2014(05)
[5]植物轉基因技術研究進展[J]. 駱翔,劉志頤,章樹民,申碩,王德福,王勁松. 中國農學通報. 2014(15)
[6]一個玉米旱敏感突變體的遺傳分析與基因定位[J]. 牟穎熙,劉艷,王國英,鄭軍. 植物遺傳資源學報. 2014(03)
[7]Panhandle PCR strategy to amplify the upstream unknown sequence of the Pr1 gene of pythium guiyangense[J]. DUAN Siliang,SU Xiaoqing,YU Sheng. Journal of Medical Colleges of PLA. 2013(05)
[8]圖位克隆技術在玉米基因分離中的應用[J]. 呂洪坤,鄭軍. 分子植物育種. 2013(03)
[9]轉基因抗蟲玉米環(huán)境安全性及我國應用前景[J]. 李寧,何康來,崔蕾,王振營. 植物保護. 2011(06)
[10]擴增T-DNA插入位點側翼序列的方法及其應用進展[J]. 祁洋,李燕,王永智,尉亞輝. 安徽農業(yè)科學. 2009(17)
本文編號：3577676
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