氣孔是植物與外界環(huán)境進(jìn)行氣體交換的主要通道,氣孔密度影響植物的光合作用效率和蒸騰速率。因此,對(duì)氣孔發(fā)育的研究一直是植物發(fā)育生物學(xué)和作物育種研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和前沿。鑒于禾本科植物葉片中氣孔構(gòu)成和分布的特殊性,對(duì)氣孔發(fā)育的研究相對(duì)于模式植物擬南芥中氣孔的研究較滯后。近年來(lái),在禾本科植物中也鑒定出了一些促進(jìn)氣孔發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,明確了它們?cè)跉饪装l(fā)育中的功能,但調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性的信號(hào)分子和機(jī)制尚未見報(bào)道。STOMAGEN基因是促進(jìn)擬南芥氣孔發(fā)育的關(guān)鍵信號(hào)分子,玉米基因組中存在兩個(gè)STOMAGN-Like基因——ZmSTOMAGEN1和ZnSTOMAGEN2基因,本實(shí)驗(yàn)室前期從玉米中克隆了STOMAGE 的同源基因ZmSTOMAGEN1,分析了該基因蛋白質(zhì)序列和三維結(jié)構(gòu),并對(duì)其在玉米中的組織表達(dá)特性進(jìn)行了研究,初步表明該基因可能與玉米氣孔發(fā)育有關(guān),但缺乏充分的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究利用CRISPR/Cas9基因組編輯、植物遺傳轉(zhuǎn)化、顯微成像和基因表達(dá)定量檢測(cè)等技術(shù)手段,進(jìn)一步分析了玉米中STOMAGEN-Like基因在氣孔發(fā)育過(guò)程中的功能,獲得了一些有意義的結(jié)果,如下:1、構(gòu)建了ZmSTOMAGEN1... 

【文章來(lái)源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：87 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 綜述
    1.1 植物氣孔發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展
        1.1.1 氣孔的發(fā)育模式
        1.1.2 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)氣孔發(fā)育的調(diào)控
        1.1.3 氣孔發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
        1.1.4 調(diào)控氣孔發(fā)育起始的分子機(jī)制
        1.1.5 保衛(wèi)細(xì)胞終末分化狀態(tài)的維持
    1.2 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組靶向編輯技術(shù)研究進(jìn)展
        1.2.1 基因組編輯技術(shù)
        1.2.2 CRISPR/Cas9在植物基因功能研究中的應(yīng)用
    1.3 研究目的及意義
    1.4 研究的主要內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料及其處理方法
        2.1.2 試劑、菌種和儀器
    2.2 引物設(shè)計(jì)
    2.3 基礎(chǔ)分子實(shí)驗(yàn)操作
        2.3.1 玉米及擬南芥基因組DNA的提取
        2.3.2 玉米及擬南芥總RNA的提取
        2.3.3 cDNA的獲得
        2.3.4 目的片段的PCR擴(kuò)增
        2.3.5 酶切反應(yīng)
        2.3.6 連接反應(yīng)
        2.3.7 重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化
        2.3.8 電轉(zhuǎn)感受態(tài)農(nóng)桿菌制備
        2.3.9 農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)化
    2.4 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建
        2.4.1 靶位點(diǎn)選擇
        2.4.2 靶點(diǎn)接頭設(shè)計(jì)
        2.4.3 sgRNA表達(dá)盒的構(gòu)建
        2.4.4 sgRNA表達(dá)盒插入pYLCRISPR/Cas9Pubi-B載體
        2.4.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞
    2.5 蛋白亞細(xì)胞定位
        2.5.1 溶液
        2.5.2 侵染液制備
        2.5.3 煙草培養(yǎng)及侵染葉片
        2.5.4 激光共聚焦成像
    2.6 擬南芥轉(zhuǎn)基因
        2.6.1 培養(yǎng)基及溶液
        2.6.2 野生型擬南芥種植
        2.6.3 侵染液的制備
        2.6.4 花序(Floral-dip)法轉(zhuǎn)化擬南芥:
        2.6.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選
        2.6.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的分子鑒定
    2.7 玉米轉(zhuǎn)基因
        2.7.1 儲(chǔ)備液及培養(yǎng)基
        2.7.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米幼胚遺傳轉(zhuǎn)化
        2.7.3 轉(zhuǎn)基因玉米的分子鑒定
    2.8 光合參數(shù)測(cè)定及光響應(yīng)曲線的擬合
    2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
    2.10 TBO染色
        2.10.1. 試劑及儲(chǔ)備液
        2.10.2. 染色步驟
    2.11 氣孔掃描電鏡觀察
    2.12 真核表達(dá)
        2.12.1 酵母培養(yǎng)與表達(dá)所需培養(yǎng)基
        2.12.2 酵母GS115感受態(tài)制備
        2.12.3 重組質(zhì)粒點(diǎn)轉(zhuǎn)化畢赤酵母
        2.12.4 多拷貝重組畢赤酵母的篩選
        2.12.5 重組畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 ZmSTOMAGEN1基因在擬南芥中的功能
        3.1.1 ZmSTOMAGEN1超表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.2 超表達(dá)ZmSTOMAGEN1擬南芥植株的獲得
        3.1.3 超表達(dá)ZmSTOMAGEN1提高擬南芥的氣孔指數(shù)/密度
    3.2 ZmSTOMAGEN1亞細(xì)胞定位
    3.3 CRISPR/Cas9靶向修飾玉米ZmSTOMAGEN-like基因
        3.3.1 ZmSTOMAGEN-like基因靶位點(diǎn)的選擇及CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建
        3.3.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)轉(zhuǎn)化玉米
        3.3.3 轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定
        3.3.4 ZmSTOMAGEN-like基因編輯結(jié)果
    3.4 STOMAGEN-like基因缺失對(duì)玉米氣孔發(fā)育的影響
        3.4.1 ZmSTOMAGEN-like基因缺失導(dǎo)致氣孔指數(shù)/密度的減少
        3.4.2 ZmSTOMAGEN-like基因缺失對(duì)氣孔發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響
        3.4.3 ZmSTOMAGEN-like基因的缺失對(duì)玉米氣孔分布和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響
    3.5 ZmSTOMAGEN-like基因的缺失對(duì)玉米光合參數(shù)的影響
    3.6 外源表達(dá)玉米STOMAGEN蛋白
        3.6.1 外源表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.6.2 外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
第四章 討論
    4.1 玉米中氣孔發(fā)育相關(guān)基因的預(yù)測(cè)
    4.2 ZmSTOMAGEN1基因正調(diào)控?cái)M南芥氣孔的發(fā)育
    4.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向修飾玉米ZmSTOMAGEN-like基因
    4.4 ZmSTOMAGEN-like基因是玉米氣孔發(fā)育的正調(diào)控因子
    4.5 玉米氣孔密度對(duì)光合作用的影響
第五章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Efficient Targeted Genome Modification in Maize Using CRISPR/Cas9 System[J]. Chao Feng,Jing Yuan,Rui Wang,Yang Liu,James A.Birchler,Fangpu Han.  Journal of Genetics and Genomics. 2016(01)
[2]植物CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)與突變分析[J]. 馬興亮,劉耀光.  遺傳. 2016(02)
[3]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao.  Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
[4]氣孔蛋白同源物在單、雙子葉植物中的生物信息學(xué)分析[J]. 樊憲偉,韋葳,廖權(quán)能,李有志.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2013(06)
[5]CRISPR/Cas系統(tǒng):RNA靶向的基因組定向編輯新技術(shù)[J]. 李君,張毅,陳坤玲,單奇?zhèn)?王延鵬,梁振,高彩霞.  遺傳. 2013(11)
[6]氣孔發(fā)育及其調(diào)控[J]. 崔國(guó)新,韓寶達(dá),趙瀟男,李立新.  植物生理學(xué)報(bào). 2012(09)

碩士論文
[1]玉米ZmSTOMAGEN基因的克隆及表達(dá)特性分析[D]. 韋葳.廣西大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3542407