木薯（Manihot esculenta Crantz）起源于南美洲,是熱帶地區(qū)重要的糧食作物和能源植物。中性/堿性轉化酶是木薯淀粉積累過程中的一種關鍵酶,前人已從木薯中克隆出了中性/堿性轉化酶基因家族的11個成員（MeNINV1～10和nINV1）,并對其結構進化和表達情況進行了分析。但將它們在染色體上進行物理定位的報道尚少。本研究以木薯華南6號品種的古銅期嫩葉為材料,制備染色體標本,采用熒光原位雜交和原位PCR技術,對木薯中性/堿性轉化酶基因家族的10個成員進行了物理定位,明確了它們的分布特點,并闡明了該基因家族與其他功能基因的連鎖關系。具體結果如下:（1）對采用木薯華南6號古銅期嫩葉制備染色體標本的方法進行了優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn):最適的預處理方法是使用飽和對二氯苯溶液處理1.5 h,最適的酶解方案是在5%纖維素酶和4%果膠酶的混合液中37℃條件下酶解4.5 h。（2）對熒光原位雜交過程中的漂洗步驟進行了優(yōu)化。結果表明,雜交后,3次漂洗的時間分別為5 min、5 min和8 min時,標本背景最干凈。（3）利用單色熒光原位雜、雙色熒光原位雜交和原位PCR技術,對木薯中性/堿性轉化酶基因家... 

【文章來源】：海南大學海南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１間接法ＨＳＨ技術的基本原理示意圖??探針與染色體雜交后，經過免疫檢測，在目標染色體上顯示熒光信號

木薯中性／堿性轉化酶基因家族的物理定位流控芯片－熒光原位雜交技術??控芯片（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐ）是一種把醫(yī)學、生物、化學等分析過程中的應、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完技術。與微流控芯片技術相結合的焚光原位雜交技術（ＦＩＳＨ?ｏｎ?ｍｉｃｒｏｃ時間內完成檢測，而且是自動完成，與傳統(tǒng)的ＦＩＳＨ相比，ＦＩＳＨｏｎｍｉｃｒｏ約７０％的試劑，而且可以大大的降低對操作人員的要求。其原理是將整對獨立的兩個部分，兩部分可以獨立的加熱、冷卻、反應，但兩者間有通。各部分又被分為周圍的裝載室和中間的反應室，以常閉閥連接。通過統(tǒng)控制各閥的開關可以控制試劑在各室間流動，其動力主要是吸入型和泵。其本質就是微泵膜轉動產生壓力差配合特定的開關引起試劑定向流應有序進行。ＦＩＳＨ?ｏｎ?ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ技術流程如圖２。??．．．???－－＾°

３．１．１．１預處理時間的優(yōu)化??本研宄采用飽和對二氯苯溶液４°Ｃ處理的方法，設置了】ｈ、１．５ｈ、２ｈ三個梯度??對預處理的最佳時長進行了摸索（圖３Ａ，?３Ｂ，３Ｃ）。結果表明：在其他條件一致的情??況下，預處理ｌｈ的材料所制備的標本中，染色體聚縮不完全，形態(tài)不清晰，不利于??染色體計數(shù)、長度測定的分析（圖３Ａ）；預處理１．５?ｈ的材料所制備的標本中，大多??中期細胞的染色體聚縮合適，無拖尾現(xiàn)象，形態(tài)清晰，很適合做核型分析（圖３Ｂ）；??預處理２ｈ的材料所制備的標本中，雖然染色體的形態(tài)清晰，但聚縮過度，長度大大??減小，著絲粒己不可辨識，不利于核型分析（圖３Ｃ）。??綜上所述，研宄認為對木薯古銅期嫩葉的預處理，宜采用飽和對二氯苯溶液４°Ｃ??條件下處理１．５?ｈ的方法，這樣獲得的材料，中期細胞更多，且染色體形態(tài)好，利于??核型分析。??ＡＢＣ??圖３不同預

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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[6]巴西橡膠樹REF、RT和SRPP基因物理定位的研究[D]. 邱海燕.海南大學 2010
[7]橡膠樹膠乳中性/堿性轉化酶基因的克隆及其表達特性研究[D]. 劉術金.海南大學 2010
[8]巴西橡膠樹HbMyb1基因和OPV-10390連鎖標記原位PCR定位的研究[D]. 高和瓊.海南大學 2008
[9]石蒜與忽地笑熒光原位雜交研究[D]. 程曉蕾.南京林業(yè)大學 2006
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本文編號：3435654