發(fā)布時(shí)間：2021-10-12 11:27

　　大豆花葉病毒（soybean mosaic virus,SMV）是馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的一種病毒,能侵染大豆并引起花葉、皺縮和壞死等癥狀,在全球大豆產(chǎn)區(qū)造成了嚴(yán)重的減產(chǎn)和品質(zhì)下降。以傳統(tǒng)育種方式培育抗SMV新品種是當(dāng)前最普遍的防治策略,但這種方法培育出的品系對(duì)SMV不同株系的抗性存在差異。同時(shí)病毒的遺傳物質(zhì)簡(jiǎn)單,往往易變異分化出不同的株系。因此傳統(tǒng)育種方法在病毒防治方面有很大的局限性。當(dāng)下發(fā)展迅速的轉(zhuǎn)基因技術(shù)和RNA干擾技術(shù)能打破這一屏障,培育出對(duì)大豆花葉病毒具有廣譜抗性的新品種。在酵母雙雜實(shí)驗(yàn)（Yeast Two Hybrid,Y2H）中發(fā)現(xiàn)大豆翻譯延伸因子1A（Soybean Translation Elongation Factor,GmEF1 A）和大豆液泡三磷酸酶（Soybean Vacuolar-ATPase,GmVATP）與SMV-P3有很強(qiáng)的互作關(guān)系,也與病毒復(fù)制相關(guān)。隨后的病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus Induced Gene Silencing,VIGS）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GmEF1A和Gm VA TP功能的阻斷或干擾能抑制SMV對(duì)大豆的侵染。但未見利用農(nóng)... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：96 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．１?ＳＭＶ基因組結(jié)構(gòu)和蛋白切割位點(diǎn)（Ｇａｇａｒｉｎｏｖａ等，２００８）??

益。??２．１農(nóng)桿菌介導(dǎo)法??農(nóng)桿菌是革蘭氏陰性菌，大量分布于土壤中。根據(jù)其侵染癥狀和質(zhì)粒類型可分為??根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌。根癌農(nóng)桿菌含有Ｔｉ質(zhì)粒，侵染植株會(huì)產(chǎn)生冠癭瘤（Ｃｒｏｗｎ??ｇａｌｌ）；發(fā)根農(nóng)桿菌含有Ｒｉ質(zhì)粒，能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生發(fā)狀根（Ｚａｅｎｅｎ等，１９７４；?Ｃｈｉｌｔｏｎ??等，１９７７，１９８２）。Ｔｉ質(zhì)粒和Ｒｉ質(zhì)粒上都含有一段侵染植物所必須的轉(zhuǎn)移ＤＮＡ??（Ｔｒａｎｓｆｅｒ－ＤＮＡ，?Ｔ－ＤＮＡ），當(dāng)農(nóng)桿菌侵染寄主后，能將Ｔ－ＤＮＡ插入到目標(biāo)植物的??基因組中（圖１．２）。因此，農(nóng)桿菌是自然界中一種天然的轉(zhuǎn)基因媒介。農(nóng)桿菌該特??性被發(fā)現(xiàn)后，它的Ｔ－ＤＮＡ經(jīng)人工修飾后轉(zhuǎn)化效率得到提升，加之組培技術(shù)的進(jìn)步，??現(xiàn)在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的（ｄｇｒａｏｋ／ｃ／ｅｎ＇ｗｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ）轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為基因工程中應(yīng)用最普??遍的一項(xiàng)生物技術(shù)。??．????（Ｉ?＾??翁?乂?＇?／?；??Ｓ?＾?＼：，?：?／ｉ?＾??？?＾?ｗｒ?＊??，Ｔ．?一；?—?，??％?＇?／??圖１．２農(nóng)桿菌介；的基因轉(zhuǎn)化欞型（Ｔｚｆｉｒａ和Ｃｉｔｏｖｓｋｙ，?２００６）??Ｆｉｇ．?１．２?Ａ?ｍｏｄｅｌ?ｆｏｒ?ｔｈｅ?Ａｇｒｏｂａｃｔｃｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｉａｎｓｆｏｒｍａｌｉｏｎ??（Ｔｚｆｉｒａａｎｄ?ａｎｄＣｉｔｏｖｓｋｙ?２００６）??５??

??大豆翻譯延伸因子１Ａ和大豆液泡三磷酸酶的大豆遺傳轉(zhuǎn)化及抗ＳＭＶ病鑒定???對(duì)ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行２％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，隨后用ＡＸＹＧＥＮ公司的ＤＮＡ凝??膠回收試劑盒回收條帶大小正確的產(chǎn)物（步驟見附錄３）。所得干擾片段送交上海華??大公司進(jìn)行測(cè)序，在ＮＣＢＩ對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行ＢＬＡＳＴ比對(duì)。??１．２．３?Ｇａｔｅｗａｙ技術(shù)快速構(gòu)建ＲＮＡｉ載體??Ｇａｔｅｗａｙ體系包括ＢＰ反應(yīng)和ＬＲ反應(yīng)兩部分，通過ＢＰ反應(yīng)構(gòu)建中間載體，再通??過ＬＲ反應(yīng)構(gòu)建表達(dá)載體（圖２．１）。體系中的入門載體ｐＤＯＮＲ２２１和表達(dá)載體??ｐＢ７ＧＷＩＷＧ２?（?ＩＩ）都保存在大腸桿菌ＤＨ５ａ菌液中。實(shí)驗(yàn)前先從擴(kuò)繁后的菌液中提??取質(zhì)粒，－２０°Ｃ中保存?zhèn)溆谩??ａｔｔＢ?ｍＰｆ??ａｆｆＳ－ｆｂｎｔｅｄ?ＰＣＲ?（?＾ｎ〇ｆ?ｊ??（?ｅｎｔｆｙ?）?ｂｙｐｒｏｄｕｃｔ??ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｒ?ａｔ（３?＼?ｖｅｃｔｏｒ?／?＼?ｃｌｏｎｅ?Ｊ??ｅｘｐｒｅｓｓａｃｓｎ?ｃｆｏｎｅ??ａｆｆｔ?ｄ?金ｉ?ｍｔＨ?ａＳｆＳＩ?Ｍ３?ａＳＢ?？ｒｔＰ?ａｉ？Ｐ??＋?ｎｗｒａＫｉｉ?ＬＳＣ，＾，?＋??ｌ?ｅｎｔｒｙ?）?ｌ?ｄｏｓＳｒｕｔｏｎ?１??？?ｌ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｊ?ｉ?Ｏｊｆ－ｐｒｏｄｏｅｔ?Ｊ??＼?ｃｔｏｒ？?／?Ｖ?ｖｏｄｅｒ?ｙ?Ｖ．?ｄｏｎ？?ｙ?Ｖ?／??圖２．１?Ｇａｔｅｗａｙ技術(shù)的反應(yīng)原理??Ｆｉｇ．?２．１?Ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?Ｇａｔｅｗａｙ?ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ??ＢＰ反應(yīng)步驟：????在１．５?ｍＬ滅菌離心管內(nèi)??配置１０卩Ｌ反應(yīng)體系（表??２

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]大豆花葉病毒P3蛋白的寄主互作因子篩選、鑒定及功能驗(yàn)證[D]. 欒鶴翔.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015



本文編號(hào)：3432489