CRISPR是一種新型的基因編輯技術(shù),被比喻為精確的分子手術(shù)刀,對人類致病基因的挖掘,疾病的靶向治療,農(nóng)業(yè)作物的品種改良,定向育種都具有巨大的潛力與前景。此項(xiàng)技術(shù)操作簡單易行,而且實(shí)驗(yàn)周期短,成本節(jié)約,易于在實(shí)驗(yàn)室中開展。CRISPR技術(shù)先后應(yīng)用于植物,動物及人體細(xì)胞中。蛹蟲草作為一種食藥用真菌,很多功效都接近于冬蟲夏草,具有減緩疲勞,軟化心血管,抗腫瘤,防輻射等作用,產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)蛹蟲草子實(shí)體體系已建立。目前尚未有蛹蟲草遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)首次在蛹蟲草中建立遺傳轉(zhuǎn)化體系,并首次利用CRISPR技術(shù)對蛹蟲草中尿嘧啶合成的關(guān)鍵酶基因URA3進(jìn)行基因編輯,使其成為一種新型的篩選標(biāo)記,為進(jìn)一步研究蛹蟲草的代謝調(diào)控,菌種優(yōu)化奠定了基因工程基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)中使用正交的方法,對農(nóng)桿菌介導(dǎo)蛹蟲草轉(zhuǎn)化的條件進(jìn)行優(yōu)化,得到最優(yōu)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件,建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)蛹蟲草原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系。成功克隆了真菌GPD啟動子,并將其成功構(gòu)建到敲除載體pFGC-pcoCas9上,從而實(shí)現(xiàn)了對植物敲除載體的改造,最終得到適用于蛹蟲草的敲除載體。運(yùn)用農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化法,將其敲除載體轉(zhuǎn)入到蛹蟲草原生質(zhì)體中,最后得到了突變的轉(zhuǎn)化... 

【文章來源】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)吉林省

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

II型CRISPR/Cas9基因座組成圖

圖 2.1 表達(dá)載體 pFGC-pcoCas9 圖譜Fig 2.1 The Map of expression vector pFGC-pcoCas9載體雙酶切 I 和 Nco I 兩種內(nèi)切酶，將連結(jié) GPD 基因序列的克隆載體質(zhì)粒進(jìn)行-pcoCas9 的載體使用相同的限制性內(nèi)切酶 Pme I 和 Nco I 酶切，將 PCR 管一起置于恒溫水浴鍋中，過夜 37 ℃酶切。雙酶切體系如表表 2-4 質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系Tab. 2-4 Restriction system of plasmid組分 體積 μLDNA 10Pme I- Buffer 5Pme I 2.5Nco I 2.5

3 野生型蛹蟲草分別在含與不含卡潮霉素+卡那霉素濃度的 PDA 培養(yǎng)基上生長 Wild Cordyceps Militaris on PDA plate with/without hygromycin + Kan in 7-15 day立農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化蛹蟲草條件的確定為帶有熒光蛋白的質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，可以使用熒光倒置顯微鏡在實(shí)驗(yàn)效果，從而證明正交試驗(yàn)的結(jié)果是否準(zhǔn)確。結(jié)果顯示在誘導(dǎo)劑乙0 μM/L，共培養(yǎng)的時間為 2 天，農(nóng)桿菌與蛹蟲草原生質(zhì)體的體積比例為佳。下表為正交試驗(yàn)的結(jié)果，可以看出 KA＞KB＞KC，說明 A 代表的濃度高低對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的影響較大。其次是共培養(yǎng)的培養(yǎng)時間，農(nóng)積例對其效果的影響相對較弱。表 3-6 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化正交試驗(yàn)Table 3-6 Agrobacterium transformation orthogonal test試驗(yàn)號 試驗(yàn)因素水平


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