植物MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA,它們參與調(diào)節(jié)植物生長、發(fā)育和代謝過程中多種基因的表達。近期的研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)節(jié)磷的吸收和利用,影響了植物對低磷脅迫的適應能力。在我們的前期研究中,通過高用量測序分析發(fā)現(xiàn),miR0078-3p在低磷脅迫小麥（CS）地下部分里差異表達。本研究克隆小麥miR0078-3p前體（pre-MIR0078-3p）,構(gòu)建過表達水稻植株,并且研究其功能。主要研究結(jié)果如下:1.根據(jù)小麥基因組序列,PCR克隆得到包含有Tae-miR0078-3p前體結(jié)構(gòu)的序列。2.成功構(gòu)建了植物表達載體pOx-pre-miR0078-3p,抗生素標記為潮霉素。3.利用農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗潮霉素（Hyg）的水稻植株。4.對得到的抗性植株進行PCR分子鑒定,獲得8株mi R0078-3p陽性水稻。q RT-PCR檢測成熟體miR0078-3p在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達量與野生型相比,PCR陽性植株MIR0078-3p表達量顯著增高。5.對miR0078-3p過表達植株和野生型水稻的靶基因OsILR1進行了表達分析。結(jié)果表明,miR0078-3p基... 

【文章來源】：哈爾濱師范大學黑龍江省

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

植物miRNA產(chǎn)生和調(diào)控途徑[43]

第2章Tae-miR0078-3p基因的克隆-17-素50mg/ml），留甘油菌，-80℃保存。pMD18T-MIR0078-3p質(zhì)粒4μl10×BufferM1μlBmaHIPstI0.5μl0.5μlH2O4μlTotal10μl酶切反應條件：37℃，30min。2.2.2.6MIR0078-3p前體基因的測序及生物信息學分析將pre-miR0078-3p核苷酸序列的測序結(jié)果通過NCBI可以獲得Blast結(jié)果，并和小麥基因組進行比對。運用在線軟件Mfold（http//mfold.ma.albany.edu/）對這段序列進行二級結(jié)構(gòu)預測。2.3實驗結(jié)果2.3.1小麥MIR0078-3p基因的克隆小麥總DNA的提取，如圖2-1圖2-1小麥總DNA電泳圖Fig.2-1ElectrophoregramoftotalDNAfromwheatM：BM2000+；1-8：小麥DNAM:BM2000+;1-8:wheatDNA通過對低磷脅迫小麥地下部分的高通量測序數(shù)據(jù)中得到上調(diào)表達的MIR0078-3p基因的核苷酸序列。根據(jù)其前體序列通過小麥基因組網(wǎng)站進行序列比對設計引

哈爾濱師范大學碩士學位論文-18-物，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物大小約500bp（圖2-2）。圖2-2PCR擴增小麥MIR0078-3p基因圖Fig.2-2PCRamplificationofMIR0078-3pgeneM：BM2000+；1-5：MIR0078-3p基因M:BM2000+;1-5:MIR0078-3pgene2.3.2pMD18T-MIR0078-3p克隆載體的構(gòu)建對MIR0078-3p基因的PCR產(chǎn)物片段進行膠回收并連接到pMD18-T載體中。此時得到重組質(zhì)粒，使用熱激轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌TOP10中，對其PCR篩選，將利用BmaHI和PstI對提取的陽性菌質(zhì)粒進行雙酶切驗證（圖2-3）。陽性菌株送于生工生物公司進行測序。圖2-3pMD18T-MIR0078-3p質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2-3IdentificationofrecombinantplasmidspMD18T-MIR0078-3pBmaHI/PstI

【參考文獻】：
期刊論文
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[2]植物微小RNA（microRNA）研究進展[J]. 王磊,范云六.  中國農(nóng)業(yè)科技導報. 2007(03)
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博士論文
[1]水稻OsARF16介導的生長素信號參與調(diào)控磷饑餓響應[D]. 沈晨佳.浙江大學 2011



本文編號：3367397