植物MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA,它們參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝過程中多種基因的表達(dá)。近期的研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)節(jié)磷的吸收和利用,影響了植物對(duì)低磷脅迫的適應(yīng)能力。在我們的前期研究中,通過高用量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),miR0078-3p在低磷脅迫小麥（CS）地下部分里差異表達(dá)。本研究克隆小麥miR0078-3p前體（pre-MIR0078-3p）,構(gòu)建過表達(dá)水稻植株,并且研究其功能。主要研究結(jié)果如下:1.根據(jù)小麥基因組序列,PCR克隆得到包含有Tae-miR0078-3p前體結(jié)構(gòu)的序列。2.成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pOx-pre-miR0078-3p,抗生素標(biāo)記為潮霉素。3.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗潮霉素（Hyg）的水稻植株。4.對(duì)得到的抗性植株進(jìn)行PCR分子鑒定,獲得8株mi R0078-3p陽(yáng)性水稻。q RT-PCR檢測(cè)成熟體miR0078-3p在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)量與野生型相比,PCR陽(yáng)性植株MIR0078-3p表達(dá)量顯著增高。5.對(duì)miR0078-3p過表達(dá)植株和野生型水稻的靶基因OsILR1進(jìn)行了表達(dá)分析。結(jié)果表明,miR0078-3p基... 

【文章來源】：哈爾濱師范大學(xué)黑龍江省

【文章頁(yè)數(shù)】：77 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

植物miRNA產(chǎn)生和調(diào)控途徑[43]

第2章Tae-miR0078-3p基因的克隆-17-素50mg/ml），留甘油菌，-80℃保存。pMD18T-MIR0078-3p質(zhì)粒4μl10×BufferM1μlBmaHIPstI0.5μl0.5μlH2O4μlTotal10μl酶切反應(yīng)條件：37℃，30min。2.2.2.6MIR0078-3p前體基因的測(cè)序及生物信息學(xué)分析將pre-miR0078-3p核苷酸序列的測(cè)序結(jié)果通過NCBI可以獲得Blast結(jié)果，并和小麥基因組進(jìn)行比對(duì)。運(yùn)用在線軟件Mfold（http//mfold.ma.albany.edu/）對(duì)這段序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1小麥MIR0078-3p基因的克隆小麥總DNA的提取，如圖2-1圖2-1小麥總DNA電泳圖Fig.2-1ElectrophoregramoftotalDNAfromwheatM：BM2000+；1-8：小麥DNAM:BM2000+;1-8:wheatDNA通過對(duì)低磷脅迫小麥地下部分的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中得到上調(diào)表達(dá)的MIR0078-3p基因的核苷酸序列。根據(jù)其前體序列通過小麥基因組網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)設(shè)計(jì)引

哈爾濱師范大學(xué)碩士學(xué)位論文-18-物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約500bp（圖2-2）。圖2-2PCR擴(kuò)增小麥MIR0078-3p基因圖Fig.2-2PCRamplificationofMIR0078-3pgeneM：BM2000+；1-5：MIR0078-3p基因M:BM2000+;1-5:MIR0078-3pgene2.3.2pMD18T-MIR0078-3p克隆載體的構(gòu)建對(duì)MIR0078-3p基因的PCR產(chǎn)物片段進(jìn)行膠回收并連接到pMD18-T載體中。此時(shí)得到重組質(zhì)粒，使用熱激轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌TOP10中，對(duì)其PCR篩選，將利用BmaHI和PstI對(duì)提取的陽(yáng)性菌質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證（圖2-3）。陽(yáng)性菌株送于生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。圖2-3pMD18T-MIR0078-3p質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2-3IdentificationofrecombinantplasmidspMD18T-MIR0078-3pBmaHI/PstI

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]不同氮肥施用量與磷肥運(yùn)籌對(duì)云光109葉長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響[J]. 郭文,郭華春,盧義宣,奎麗梅,楊從黨,李貴勇,隋學(xué)藝.  西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2012(03)
[2]植物微小RNA（microRNA）研究進(jìn)展[J]. 王磊,范云六.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào). 2007(03)
[3]微波處理對(duì)離體黃瓜子葉生根和根活力的影響[J]. 黃桂琴,劉 準(zhǔn),張春香,廖祥軍,Vijaya Raghavan,戴建明.  微波學(xué)報(bào). 2002(01)

博士論文
[1]水稻OsARF16介導(dǎo)的生長(zhǎng)素信號(hào)參與調(diào)控磷饑餓響應(yīng)[D]. 沈晨佳.浙江大學(xué) 2011



本文編號(hào)：3367397