發(fā)布時間：2021-08-24 17:54

　　CRISPR/Cas9技術(shù)是一門新興的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù),具有操作簡單、高效的優(yōu)點(diǎn),可輕松實現(xiàn)對目標(biāo)基因的敲除、替換和定點(diǎn)突變等操作。本論文以茶樹咖啡因合成酶編碼基因（TCS）為靶基因,聯(lián)合采用常規(guī)PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技術(shù),構(gòu)建了包含茶樹TCS雙靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9基因編輯載體。與此同時,對茶樹遺傳轉(zhuǎn)化與再生體系進(jìn)行了優(yōu)化,并將TCS靶向的CRISPR/Cas9基因編輯載體導(dǎo)入茶樹細(xì)胞進(jìn)行了表達(dá)。本文主要研究結(jié)果如下:1、構(gòu)建了茶樹咖啡因合成酶基因組編輯載體根據(jù)TCS基因組序列設(shè)計了兩個靶序列T1和T2,并合成相應(yīng)引物,以pYLgRNA-AtU3d-LacZ載體為模板通過常規(guī)PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得U3d啟動子和連接T1靶序列的T1-gRNA片段,以pYLgRNA-AtU3b為模板通過常規(guī)PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得U3b啟動子和連接T2靶序列的T2-gRNA片段;采用Overlapping PCR技術(shù)將U3d啟動子片段和T1-gRNA片段連接在一起組裝成T1sgRNA表達(dá)盒,采用同樣的技術(shù)將U3b啟動子片段和T2-gRNA片段一起組裝... 

【文章來源】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)
        1.1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展歷史
        1.1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與作用原理
        1.1.3 CRISPR/Cas9與其它常用基因組編輯技術(shù)的比較
        1.1.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在各類常見經(jīng)濟(jì)作物上的應(yīng)用
    1.2 茶樹再生體系研究進(jìn)展
        1.2.1 茶樹組織培養(yǎng)研究進(jìn)展
        1.2.2 生根培養(yǎng)
        1.2.3 茶樹組織培養(yǎng)中的影響因素
    1.3 茶樹遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展
        1.3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)茶樹的遺傳轉(zhuǎn)化
        1.3.2 其它遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)
    1.4 研究目的及意義
    1.5 研究內(nèi)容
        1.5.1 CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建
        1.5.2 茶樹組織培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化
        1.5.3 茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化
        1.5.4 分子檢測
第二章 茶樹咖啡因合成酶基因組編輯載體的構(gòu)建
    2.1 材料與方法
        2.1.1 質(zhì)粒、引物、菌種與試劑
        2.1.2 sgRA序列設(shè)計及分析
        2.1.3 sgRNA表達(dá)盒構(gòu)建方法
        2.1.4 組裝sgRNA表達(dá)盒到pYLCRISPR/Cas9載體
        2.1.5 酶切-連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與質(zhì)粒提取
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 sgRNA設(shè)計
        2.2.2 質(zhì)粒提取
        2.2.3 sgRNA表達(dá)盒的構(gòu)建
        2.2.4 兩個sgRNA表達(dá)盒的拼接及與Cas9雙元表達(dá)載體的組合
        2.2.5 測序驗證
    2.3 小結(jié)與討論
第三章 茶樹組織培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 試驗方法
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 不同培養(yǎng)基對茶樹無菌苗培養(yǎng)的影響
        3.2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對茶樹脫分化效果的影響
        3.2.3 不同外植體對茶樹脫分化效果的影響
        3.2.4 不同茶樹品種對茶樹脫分化的影響
        3.2.5 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇
        3.2.6 生根培養(yǎng)
    3.3 小結(jié)與討論
第四章 茶樹咖啡因合成酶基因組編輯載體的遺傳轉(zhuǎn)化
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 不同外植體對轉(zhuǎn)化效率的影響
        4.2.2 轉(zhuǎn)基因篩選濃度的選擇
        4.2.3 農(nóng)桿菌抑制劑濃度的選擇
        4.2.4 農(nóng)桿菌的濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響
        4.2.5 乙酰丁香酮(As)對轉(zhuǎn)化效率的影響
        4.2.6 茶樹體細(xì)胞胚DNA提取
        4.2.7 轉(zhuǎn)基因茶樹體細(xì)胞胚的PCR驗證
        4.2.8 抗性體細(xì)胞胚DNA測序
    4.3 小結(jié)與討論
第五章 總結(jié)與展望
    5.1 主要研究成果
    5.2 主要創(chuàng)新點(diǎn)
    5.3 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]植物基因組編輯及衍生技術(shù)最新研究進(jìn)展[J]. 單奇?zhèn)?高彩霞.  遺傳. 2015(10)
[2]不同成熟度茶籽外植體誘導(dǎo)發(fā)生體胚的研究[J]. 李曉東,向勤锃,高吉剛,張麗霞.  中國農(nóng)學(xué)通報. 2010(18)
[3]花粉管通道法對茶樹進(jìn)行dsTCS基因轉(zhuǎn)化的初步研究[J]. 李玲玲,江昌俊,房婉萍,鄧威威.  安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2007(01)
[4]茶樹愈傷組織誘導(dǎo)和組織培養(yǎng)[J]. 楊國偉,蘭蓉,王曉杰,辛秀蘭.  江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué). 2006(04)
[5]不同激素配比對茶樹苗組織培養(yǎng)的影響[J]. 王云.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2006(14)
[6]發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化茶樹的研究[J]. 彭正云,劉德華,肖海軍,蔣立文,張麗霞,向勤锃,唐道方.  湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2006(02)
[7]茶樹組培快繁技術(shù)的優(yōu)化研究[J]. 周健,成浩,王麗鴛.  茶葉科學(xué). 2005(03)
[8]藪北茶的組織培養(yǎng)[J]. 張婭婷,張偉.  周口師范學(xué)院學(xué)報. 2004(05)
[9]不同品種茶樹愈傷組織的培養(yǎng)與茶氨酸的積累[J]. 袁弟順,林麗明,孫威江,林金科.  福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2004(02)
[10]茶樹的組培快繁技術(shù)初探[J]. 張建華,毛平生,彭火輝.  蠶桑茶葉通訊. 2003(04)

博士論文
[1]農(nóng)桿菌及基因槍介導(dǎo)的茶樹外源基因?qū)塍w系優(yōu)化研究[D]. 吳姍.浙江大學(xué) 2004

碩士論文
[1]茶樹組織培養(yǎng)再生體系優(yōu)化與遺傳轉(zhuǎn)化的研究[D]. 許益娟.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[2]茶氨酸生物合成研究[D]. 高秀清.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2002



本文編號：3360453