為了明確小麥冰重結(jié)晶抑制蛋白基因（TaIRI5）在小麥生長發(fā)育過程中的作用,該研究以小麥品種‘北京841’為材料,利用RT-PCR方法克隆TaIRI5基因,并對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析、組織特異性表達(dá)分析、啟動子活性分析以及亞細(xì)胞定位分析。結(jié)果顯示:（1）成功克隆到TaIRI5基因,該基因全長1 203 bp,開放閱讀框為858 bp,編碼285個氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為70.7 kD,等電點為5.07,屬于疏水性蛋白。（2）實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,TaIRI5基因在小麥的根、莖、葉片、雌蕊、雄蕊、護(hù)穎、種子中均有表達(dá),其中根部的相對表達(dá)量最高,在雌蕊中表達(dá)量最低,表明該基因在小麥的生長發(fā)育過程中起重要作用。（3）TaIRI5基因的啟動子分析表明,該區(qū)域除CAAT-box和TATA-box啟動子核心元件外,該序列還包含9個光響應(yīng)元件和6個激素應(yīng)答元件及其他元件;利用TaIRI5基因不同長度（498 bp、999 bp、1 500 bp）的3個候選啟動子,構(gòu)建了含有GUS基因的pCAMBIA1301融合表達(dá)載體;煙草轉(zhuǎn)化實驗表明,3個候選啟動子都能啟動該基因的表達(dá),但表達(dá)模式略有差異。... 

【文章來源】：西北植物學(xué)報. 2020,40(01)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

啟動子活性檢測

采用RT-PCR方法,從小麥品種‘北京841’中擴(kuò)增出TaIRI5基因。小麥TaIRI5基因全長1 203 bp(圖1),其中ORF長度為858 bp,共編碼285個氨基酸。在線網(wǎng)站Protparam分析TaIRI5基因編碼的蛋白質(zhì)分子式為C2525H4194N858O1047S226,蛋白質(zhì)分子量約為70.7 kD,等電點為5.07,蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)(instability index)為61.64,推測其屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)�？偲骄杷禂�(shù)(GRAVY)為0.829,為疏水性蛋白(圖2)。用PSORT Ⅱ Prediction預(yù)測TaIRI5位于細(xì)胞膜的可能性為77.8%,位于液泡的可能性為22.2%。用NCBI的Conserved Domains分析其結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)共有兩個,一個是冰重結(jié)晶抑制結(jié)構(gòu)域,另一個是亮氨酸富集結(jié)構(gòu)域(圖3)。用PRABI信息庫預(yù)測蛋白質(zhì)序列的二級結(jié)構(gòu),該蛋白序列中有23.86% α螺旋,7.37% β折疊,22.81%延伸主鏈,45.96%隨機卷曲(圖4)。在NCBI網(wǎng)站上對TaIRI5蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模,結(jié)果如圖5, TaIRI5蛋白的三級結(jié)構(gòu)呈規(guī)則的螺旋狀,推測該蛋白質(zhì)具有很強的穩(wěn)定性。

啟動子區(qū)分析發(fā)現(xiàn),該啟動子區(qū)的大量核心元件分別集中于ATG前32 ～ 490 bp和1 022 ～ 1 405 bp(表2),根據(jù)其核心啟動子分布位置不同構(gòu)建ATG前498 bp、999 bp、1 500 bp 3個不同長度的啟動子融合表達(dá)載體(圖9)。同時構(gòu)建隨機序列(Random,900 bp)代替啟動子序列為對照[pTaIRI5(R)∷GUS],分析其啟動子活性。除了CAAT-box和TATA-box這2個啟動子核心元件外,該序列還包含一些不同的光響應(yīng)元件和激素應(yīng)答元件,該序列共含有9個光響應(yīng)及調(diào)控元件如AE-box、Box 4、GATA-motif等,6個參與激素調(diào)節(jié)的作用元件如ABRE、TATC-box、TGACG-motif、CGTCA-motif等。除了這些元件之外,該序列還含有一些其他元件,如葉肉細(xì)胞柵欄組織分化的相關(guān)元件(HD-Zip1)、參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控的順式作用元件(O2-site)、厭氧誘導(dǎo)所必需的順式元件(ARE)、MYB轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)元件(CCAAT-box)等。圖3 小麥TaIRI5基因結(jié)構(gòu)域

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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[4]氣候變化背景下河南省冬小麥品種更新特征[D]. 孫倩.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
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本文編號：3320078