煙草是典型的喜鉀作物。鉀不僅從多個方面參與煙草的生長發(fā)育,還作為重要的品質(zhì)元素,調(diào)節(jié)煙草的生理生化反應(yīng),影響煙葉的品質(zhì)、燃燒性和煙制品的安全性。煙草對K⁺的吸收主要由鉀通道和鉀轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)。Shaker家族鉀通道是研究最早、最為深入的一類鉀通道。挖掘煙草關(guān)鍵Shaker鉀通道基因,解析其在鉀素營養(yǎng)過程中的功能和調(diào)控機制,對煙草的高鉀遺傳改良具有重要意義。本研究分別以林煙草（Nicotiana sylvestris）Shaker鉀通道NsylNKT6和絨毛狀煙草（N.tomentosiformis）Shaker鉀通道NtomSKOR1為研究對象,通過生物信息學(xué)分析、組織化學(xué)染色和過表達材料的表型鑒定等試驗,對兩個基因在鉀吸收轉(zhuǎn)運方面的功能進行初步探究。為明確NsylNKT6的組織表達模式,對該基因啟動子序列進行了順式作用元件預(yù)測。結(jié)果表明,NsylNKT6啟動子含有光響應(yīng)元件、植物激素響應(yīng)元件（脫落酸、乙烯和赤霉素等）、脅迫響應(yīng)元件（厭氧、干旱、抗病和傷口等）和分生組織表達元件等,推測該基因的表達可能受到光、激素和脅迫等多種環(huán)境信號的調(diào)控。進一步獲得了NsylNKT6... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

植物Shaker鉀通道的結(jié)構(gòu)（LEBAUDYetal.,2007）

抑制，但其具體功能尚不清楚（靳義榮 等，2013a）1602-1611。在此基礎(chǔ)上，本部分工作通過啟動子融合 GUS 報告基因明確 NsylNKT6 的組織表達；重新克隆 NsylNKT6 編碼區(qū)，結(jié)合酵母異源表達試驗確定其是否具有鉀吸收功能；篩選獲得過表達 NsylNKT6 的擬南芥和煙草純合材料，對其進行表型觀察和鉀含量測定。通過以上研究，解析 NsylNKT6 在鉀吸收轉(zhuǎn)運方面的功能。 3.1 NsylNKT6 啟動子的克隆及其活性分析 3.1.1 NsylNKT6 啟動子的順式作用元件預(yù)測 本課題組前期以林煙草基因組 DNA 為模板，通過基因特異性引物擴增，獲得了長度為 1981 bp 的 NsylNKT6 啟動子序列（靳義榮，2013b; 圖 3-1，附錄 C），該啟動子序列位于 NsylNKT6 起始密碼子 ATG 上游-20~-2000 bp 處（以 ATG 的 A 堿基處設(shè)定為 1）。將該片段連入 pMD19-T 后獲得 pMD19-T-NsylNKT6pro 質(zhì)粒。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第三章林煙草NsylNKT6參與植物鉀吸收轉(zhuǎn)運的功能分析173.1.2林煙草ProNsylNKT6::GUS轉(zhuǎn)基因植株的獲得以pMD19-T-NsylNKT6pro質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR在NsylNKT6啟動子兩端分別引入XbaⅠ和SmaⅠ酶切位點及相應(yīng)保護堿基，經(jīng)酶切后連入pBI101相應(yīng)酶切位點，獲得NsylNKT6啟動子驅(qū)動GUS的表達載體pBI101-NsylNKT6pro。采用葉盤轉(zhuǎn)化法將ProNsylNKT6::GUS片段轉(zhuǎn)入林煙草，獲得T0代植株。基因組PCR檢測結(jié)果顯示（圖3-3），7份T0代材料（編號1、2、4、5、6、8、9）為轉(zhuǎn)基因陽性材料。收獲上述材料的嚴格自交種T1代，經(jīng)平板抗性篩選后，所獲陽性株用于后續(xù)GUS組織化學(xué)染色。圖3-3林煙草ProNsylNKT6::GUS轉(zhuǎn)基因植株的基因組PCR陽性鑒定Fig.3-3GenomicidentificationofProNsylNKT6::GUStransgenicN.sylvestris注：M：DNAMarkerDL1000；+：陽性對照（陽性質(zhì)粒）；-：陰性對照（野生型林煙草）；1-9：T0代植株編號；下劃線編號表示陽性植株。Note:M:DNAMarkerDL1000;+:thepositivecontrol;-:thenegativecontrol(N.Sylvestris);1-9:plantnumbersofT0generation;underlinednumbersmeanpositiveplants.3.1.3轉(zhuǎn)ProNsylNKT6::GUS林煙草材料的GUS組織化學(xué)染色在出苗期（種子萌發(fā)后7d）和團棵期（種子萌發(fā)后60d），選取正常培養(yǎng)條件下的轉(zhuǎn)ProNsylNKT6::GUS林煙草材料，進行GUS組織化學(xué)染色。結(jié)果表明，種子萌發(fā)7d時，在葉片的保衛(wèi)細胞檢測到明顯的GUS活性，在葉片的其他組織和根部均未檢測到GUS活性（圖3-4）。圖3-4種子萌發(fā)后7dProNsylNKT6::GUS轉(zhuǎn)基因林煙草的GUS染色結(jié)果Fig.3-4GUSstainingresultsofProNsylNKT6::GUStransgenicN.sylvestris7daftergermination注：A、B：葉；C、D：根；所有染色結(jié)果來自種子萌發(fā)后7d的轉(zhuǎn)基因林煙草幼苗；比例尺


本文編號：3272487