微生物對于改善農(nóng)田、增加作物產(chǎn)量以及抑制病蟲害等方面發(fā)揮著重要的功能。本研究以松遼平原通遼地區(qū)玉米主要種植地采集玉米根際土、植株（根、莖、葉）為研究對象,分離、鑒定玉米內(nèi)生固氮菌,借助qPCR、DGGE技術(shù)以及Illumina高通量測序?qū)τ衩赘H、不同部位（根、莖、葉）內(nèi)生固氮菌、細菌、真菌的多樣性進行研究。主要研究結(jié)果如下:（1）玉米根際及不同部位內(nèi)生固氮菌分離、鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析及生物學(xué)特性研究:從6個玉米樣品的根際土、根內(nèi)、莖內(nèi)、葉內(nèi)共分離到153株具有nifH基因的固氮細菌,經(jīng)16S rDNA擴增、測序比對發(fā)現(xiàn)這些固氮菌主要來自24個屬。其中優(yōu)勢菌屬為Enterobacter;Flavobacterium;Klebsiella;Pseudomonas;Kosakonia;Rhizobium。通過Biolog測定確定菌株碳源利用,結(jié)果顯示絕大多數(shù)菌株能夠以淀粉為碳源生長。7株內(nèi)生固氮菌具有ACC脫氨酶活性,活性在0.04-5.388umol/mg/h之間。（2）借助nifH基因通過qPCR、RT-PCR、DGGE、高通量測序技術(shù)對玉米根際及不同部位（根、莖、葉）內(nèi)生固氮菌多樣性及... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 植物與微生物互作體系
        1.1.1 根際土壤微生物研究進展
        1.1.2 植物內(nèi)生菌研究進展
    1.2 固氮菌研究進展
        1.2.1 聯(lián)合固氮菌的研究意義
        1.2.2 聯(lián)合固氮作用的影響因素
        1.2.3 聯(lián)合固氮作用的展望
    1.3 微生物多樣性的研究方法
        1.3.1 變性梯度凝膠電泳（DGGE）
        1.3.2 熒光定量PCR（qPCR）
        1.3.3 高通量測序技術(shù)
    1.4 研究目的與意義
    1.5 技術(shù)路線
第二章 玉米內(nèi)生固氮菌及根際土固氮菌分離、鑒定
    2.1 試驗材料
        2.1.1 樣品信息
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 所用引物
    2.2 試驗方法
        2.2.1 菌株的分離
            2.2.1.1 耐熱菌分離
            2.2.1.2 根際固氮菌分離
            2.2.1.3 內(nèi)生固氮菌分離
        2.2.2 菌株的純化和保存
            2.2.2.1 菌種的純化
            2.2.2.2 菌種的保存
        2.2.3 菌株nifH基因擴增及序列測定
            2.2.3.1 細菌總DNA小量提取
            2.2.3.2 引物
            2.2.3.3 PCR反應(yīng)體系與條件
            2.2.3.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測
        2.2.4 16S rDNA的擴增以及序列測定
        2.2.5 菌株Bilolog測定
        2.2.6 菌株ACC脫氨酶活性測定
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 篩選固氮菌株
        2.3.2 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建
        2.3.3 耐熱菌、內(nèi)生菌以及根際土固氮細菌Biolog測定
        2.3.4 菌株ACC脫氨酶活性測定
    2.4 小結(jié)與討論
第三章 玉米根際及不同部位內(nèi)生固氮菌多樣性及活性研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 供試樣品
        3.1.2 實驗菌株與克隆載體
        3.1.3 酶和試劑
        3.1.4 引物合成與基因測序
    3.2 實驗方法
        3.2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
        3.2.2 質(zhì)粒的酶切與連接
        3.2.3 質(zhì)粒提取
        3.2.4 大腸桿菌感受態(tài)的制備
        3.2.5 玉米樣品不同部位總DNA的提取
        3.2.6 玉米樣品不同部位總RNA的提取
        3.2.7 根際土總DNA提取
        3.2.8 根際土總RNA提取
        3.2.9 變性梯度凝膠電泳分析（DGGE）與測序
        3.2.10 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.2.11 高通量測序準(zhǔn)備
    3.3 結(jié)果分析
        3.3.1 玉米根際土及不同部位內(nèi)生固氮菌固氮基因數(shù)量
        3.3.2 玉米根際土及不同部位內(nèi)生固氮菌多樣性及活性分析
        3.3.3 玉米根際土及不同部位內(nèi)生固氮活性菌株分析
    3.4 討論
第四章 玉米根際土及不同部位內(nèi)生細菌群落多樣性
    4.1 實驗材料
        4.1.1 供試樣品
    4.2 實驗方法
        4.2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
        4.2.2 玉米樣品不同部位總DNA的提取
        4.2.3 根際土總DNA提取
        4.2.4 高通量測序準(zhǔn)備
        4.2.5 土壤理化性質(zhì)測定
    4.3 結(jié)果分析
        4.3.1 玉米根際土、不同部位內(nèi)生細菌群落多樣性
        4.3.2 玉米根際微生物多樣性與土壤理化性質(zhì)之間RDA分析
        4.3.3 玉米根際土、不同部位內(nèi)生細菌群落功能預(yù)測
    4.4 討論
第五章 玉米根際及不同部位內(nèi)生真菌群落多樣性
    5.1 實驗材料
        5.1.1 供試樣品
    5.2 實驗方法
        5.2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
        5.2.2 玉米樣品不同部位總DNA的提取
        5.2.3 根際土總DNA提取
        5.2.4 高通量測序準(zhǔn)備
        5.2.5 土壤理化性質(zhì)測定
    5.3 結(jié)果分析
        5.3.1 玉米根際土、不同部位內(nèi)生真菌群落多樣性
        5.3.2 玉米根際微生物多樣性與土壤理化性質(zhì)之間RDA分析
    5.4 討論
第六章 全文總結(jié)
參考文獻
附錄
致謝
作者簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
[1]尕海湖濕地泥炭細菌多樣性分析[J]. 靳亮,高學(xué)梅,杜建華,王洪秀,關(guān)麗梅,王金昌,魏國汶,邱小忠.  微生物學(xué)通報. 2016(11)
[2]中國三大區(qū)域玉米產(chǎn)量及增長率的因素分解[J]. 苗珊珊,徐永金,陸遷.  湖北農(nóng)業(yè)科學(xué). 2014(12)
[3]紅樹內(nèi)生細菌AiL3抗菌蛋白對杧果炭疽菌的抑制作用[J]. 黃勤知,余莎,何紅,盧乃會.  果樹學(xué)報. 2013(06)
[4]微生物多樣性研究進展與展望[J]. 賀紀(jì)正,郭良棟.  生物多樣性. 2013(04)
[5]土壤生態(tài)系統(tǒng)微生物多樣性-穩(wěn)定性關(guān)系的思考[J]. 賀紀(jì)正,李晶,鄭袁明.  生物多樣性. 2013(04)
[6]基于可見/近紅外光譜的土壤有機質(zhì)快速測定方法的研究[J]. 胡林,丘耘,周國民.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2012(12)
[7]淺析火焰光度法測定土壤速效鉀的關(guān)鍵因素[J]. 何琳華,曹紅娣,李新梅,徐海芳,王若玉,莊國民.  上海農(nóng)業(yè)科技. 2012(02)
[8]我國玉米種植區(qū)分布的氣候適宜性[J]. 何奇瑾,周廣勝.  科學(xué)通報. 2012(04)
[9]呼倫貝爾草原土壤固氮微生物nifH基因多樣性與群落結(jié)構(gòu)[J]. 文都日樂,李剛,楊殿林,張靜妮,易津.  生態(tài)學(xué)雜志. 2011(04)
[10]植物內(nèi)生菌的研究概況及應(yīng)用進展[J]. 肖淑賢,高俊明.  農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備. 2011(02)

碩士論文
[1]湖南水稻內(nèi)生固氮菌資源收集及特性研究[D]. 袁梅.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2016
[2]堿蓬內(nèi)生細菌的分離鑒定及抑菌活性研究[D]. 劉詩揚.沈陽師范大學(xué) 2011



本文編號：3157352