豆科植物（legume）能夠與根瘤菌（rhizobia）產(chǎn)生特異性的相互作用,進(jìn)而在根部形成高度特化的器官--根瘤（nodule）,這個(gè)過程也被稱作根瘤共生（Root Nodule Symbiosis,RNS）。在根瘤中,宿主植物為根瘤菌提供碳源以及穩(wěn)定的生存環(huán)境,根瘤菌則通過固氮酶的固氮作用將大氣中游離的氮?dú)猓∟₂）還原成氨（ammonia）以促進(jìn)植物生長(zhǎng),二者互利互惠和諧共存。近20年以來的研究主要以模式豆科植物百脈根（Lotus japonicus）和蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）為材料,通過正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)等方法鑒定到了約200個(gè)參與RNS的基因,極大的豐富了我們對(duì)共生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的認(rèn)識(shí)。其中共生受體激酶Sym RK是根瘤菌與豆科植物之間早期信號(hào)識(shí)別的一個(gè)關(guān)鍵基因,但是其調(diào)控機(jī)制尚不完善。本研究以百脈根為材料,利用蛋白相互作用、CRISPR基因敲除、植物遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)探討了Sym RK及其互作蛋白在根瘤共生早期的功能,主要結(jié)果如下:1. 利用百脈根根瘤菌MAFF303099、人工合成的細(xì)菌鞭毛蛋白N端22個(gè)保守氨基酸（flg22）... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：161 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第一章 研究綜述
    1.1 共生固氮研究概述
        1.1.1 共生固氮的概念與意義
        1.1.2 根瘤共生固氮
        1.1.3 根瘤的形成過程
        1.1.4 豆科植物與根瘤菌間早期信號(hào)分子的識(shí)別
    1.2 植物免疫研究進(jìn)展
        1.2.1 植物的免疫反應(yīng)
        1.2.2 PTI
        1.2.3 ETI
        1.2.4 PTI與 ETI的協(xié)同作用
    1.3 LRR類受體蛋白激酶
        1.3.1 共生受體激酶SymRK
        1.3.2共受體BAK1
    1.4 蛋白的泛素化修飾
第二章 豆科共生受體激酶SymRK調(diào)控植物免疫防御反應(yīng)的分子機(jī)制
    1 前言
        1.1 根瘤菌規(guī)避植物的PTI
        1.2 根瘤菌對(duì)植物免疫的調(diào)節(jié)
        1.3 植物自生對(duì)免疫的調(diào)節(jié)
        1.4 本研究的目的與意義
    2 材料與方法
        2.1 植物材料
        2.2 載體和菌株
        2.3 百脈根毛根轉(zhuǎn)化
            2.3.1 種子的萌發(fā)
            2.3.2 農(nóng)桿菌侵染與共培養(yǎng)
            2.3.3 毛根鑒定（GUS染色）
            2.3.4 毛根鑒定（熒光鑒定）
        2.4 百脈根穩(wěn)定轉(zhuǎn)化
            2.4.1 注意事項(xiàng)
            2.4.2 相關(guān)試劑
            2.4.3 種子的萌發(fā)
            2.4.4 農(nóng)桿菌侵染與共培養(yǎng)
            2.4.5 愈傷篩選
            2.4.6 芽誘導(dǎo)
            2.4.7 莖誘導(dǎo)莖伸長(zhǎng)
            2.4.8 根誘導(dǎo)
            2.4.9 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化種子的篩選（潮霉素）
        2.5 擬南芥花序侵染轉(zhuǎn)化
            2.5.1 擬南芥植株的準(zhǔn)備
            2.5.2 轉(zhuǎn)化菌株的準(zhǔn)備
            2.5.3 潮霉素篩選種子
        2.6 幼苗處理
            2.6.1 百脈根幼苗處理
            2.6.2 擬南芥幼苗處理
            2.6.3 植物蛋白抽提
        2.7 植物基因組抽提
        2.8 百脈根LORE1突變體鑒定
        2.9 表達(dá)分析
            2.9.1 總RNA的制備
            2.9.2 Real-Time PCR
        2.10 Gibson等溫一步法
            2.10.1 Gibson反應(yīng)液的配置
            2.10.2 Gibson法克隆步驟
        2.11 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）
            2.11.1 主要試劑的配置
            2.11.2 主要操作步驟
        2.12 WB實(shí)驗(yàn)步驟
        2.13 原核蛋白表達(dá)與純化
            2.13.1 小規(guī)模誘導(dǎo)
            2.13.2 大規(guī)模誘導(dǎo)
            2.13.3 蛋白純化
            2.13.4 蛋白超濾
        2.14 ROS測(cè)定
        2.15 磷酸化
            2.15.1 SDS–PAGE膠的選擇
            2.15.2 磷酸化
            2.15.3 電泳
            2.15.4 壓屏
            2.15.5 掃屏
            2.15.6 注意事項(xiàng)
        2.16 酵母雙雜交系統(tǒng)
            2.16.1 酵母培養(yǎng)基
            2.16.2 酵母雙雜交相關(guān)試劑
            2.16.3 醋酸鋰（LiAC）高效轉(zhuǎn)化酵母方法
            2.16.4 酵母的小范圍Mating
        2.17 免疫共沉淀
    3 結(jié)果與分析
        3.1 flg22激發(fā)百脈根免疫反應(yīng)
        3.2 根瘤菌激發(fā)百脈根免疫反應(yīng)
        3.3 百脈根中根瘤菌預(yù)處理抑制flg22 激活的MPK磷酸化
        3.4 根瘤菌預(yù)處理抑制flg22 激活的免疫反應(yīng)依賴于SymRK
            3.4.1 symrk突變體的鑒定
            3.4.2 根瘤菌預(yù)處理抑制flg22 激活的MPK磷酸化依賴于SymRK
            3.4.3 根瘤菌預(yù)處理抑制flg22 激發(fā)的ROS依賴于SymRK
            3.4.4 根瘤菌預(yù)處理抑制flg22 激發(fā)的免疫相關(guān)基因表達(dá)依賴于SymRK
        3.5 LjBAK1/SERK3 的鑒定與克隆
        3.6 LjBAK1是At BAK1 在百脈根中的同源基因
            3.6.1 LjBAK1同源基因的鑒定
            3.6.2 LjBAK1 具有與At BAK1 類似的功能
        3.7 LjBAK1與SymRK的相互作用
        3.8 SymRK抑制LjBAK1 的自磷酸化和底物水平磷酸化
        3.9 根瘤菌預(yù)處理抑制flg22 介導(dǎo)的BAK1 的磷酸化
        3.10 Ljbak1突變體表型分析
            3.10.1 CRISPR敲除LjBAK1（由本人及汪濤、劉超合作完成）
            3.10.2 Ljbak1突變體發(fā)育受阻（由本人及汪濤、劉超合作完成）
            3.10.3 LjBAK1參與免疫
            3.10.4 LjBAK1負(fù)調(diào)控共生
        3.11 超表達(dá)SymRK抑制flg22 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)
    4 總結(jié)與討論
        4.1 總結(jié)
        4.2 討論
            4.2.1 根瘤共生早期的免疫抑制
            4.2.2 SymRK與 LjBAK1 的相互磷酸化
第三章 百脈根中E3泛素連接酶SIE3調(diào)控共生信號(hào)機(jī)制的研究
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 植物材料
        2.2 載體和菌株
        2.3 雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）
        2.4 煙草蛋白表達(dá)
        2.5 百脈根毛根轉(zhuǎn)化
        2.6 酵母雙雜交系統(tǒng)
        2.7 表達(dá)分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 SIE3與SIP1 的相互作用（由本人及袁松麗合作完成）
        3.2 SIE3的二聚化
        3.3 SIE3第266位半胱氨酸影響其二聚化
        3.4 Cys266 影響SIE3 的生物學(xué)功能
    4 總結(jié)與討論
        4.1 總結(jié)
        4.2 討論
參考文獻(xiàn)
附錄一 :本研究所用引物
附錄二 :B&D無氮營養(yǎng)液配方
附錄三 :論文發(fā)表情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Molecular Analysis of Legume Nodule Development and Autoregulation[J]. Brett J. Ferguson,Arief Indrasumunar,Satomi Hayashi,Yu-Hsiang Lin,Dugald E. Reid,Peter M. Gresshoff.  Journal of Integrative Plant Biology. 2010(01)

博士論文
[1]泛素連接酶SIE3在百脈根結(jié)瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中功能及作用機(jī)制的研究[D]. 袁松麗.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013

碩士論文
[1]百脈根泛素連接酶SIE3對(duì)共生受體SymRK調(diào)控機(jī)制的研究[D]. 付偉偉.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014



本文編號(hào)：3152161