甘蔗是重要的糖料和能源作物,生長(zhǎng)周期長(zhǎng)且需肥量大,氮肥是影響甘蔗生長(zhǎng)的主要因子之一。大量氮肥的投入使用,雖然保證了甘蔗的生長(zhǎng)發(fā)育,但是對(duì)土壤和環(huán)境也造成了極大的破壞。因此研究利用甘蔗的聯(lián)合固氮能力,對(duì)甘蔗生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)都具有重要意義。甘蔗與聯(lián)合固氮菌的互作是一個(gè)復(fù)雜的生物過程,受到各種生物因素和非生物因素的影響。nifH基因編碼固氮酶鐵蛋白,被認(rèn)為是固氮微生物含有的最保守的功能基因。本研究以大田生長(zhǎng)的甘蔗為材料,用不同引物在DNA、蛋白質(zhì)水平檢測(cè)葉片和莖中nifH基因,同時(shí)在RNA水平、蛋白質(zhì)水平分析氮肥對(duì)不同品種甘蔗葉片nifH表達(dá)的影響,欲揭示氮肥對(duì)甘蔗固氮菌發(fā)揮作用的影響。研究結(jié)果主要如下:1.以大田ROC22甘蔗葉片和莖為材料:用三對(duì)nifH通用引物UedaR/UedaF、ZehrF/ZehrR、PolyF/PolyR PCR 檢測(cè)nifH基因,發(fā)現(xiàn) PolyF/PolyR 引物對(duì) nifH基因的擴(kuò)增效果較好;用Western blot方法檢測(cè)nifH蛋白,在葉片中檢測(cè)到了nifH蛋白,但是在莖中未檢測(cè)到2.以施氮處理和不施氮處理下大田生長(zhǎng)的GXB9、ROC22和GT11三個(gè)甘... 

【文章來源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：78 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 前言
    1.1 內(nèi)生固氮菌
    1.2 內(nèi)生固氮細(xì)菌的生物學(xué)作用
        1.2.1 生物固氮作用
        1.2.2 促生作用
        1.2.3 溶磷作用
        1.2.4 提高植物的抗逆性
    1.3 影響內(nèi)生固氮菌的因素
    1.4 nifH基因
        1.4.1 nifH基因的特征及分類
        1.4.2 環(huán)境樣品中nifH多樣性的檢測(cè)
        1.4.3 nifH基因多樣性的研究方法
    1.5 甘蔗的聯(lián)合固氮研究
    1.6 國(guó)內(nèi)甘蔗內(nèi)生固氮菌研究
    1.7 本研究的目的及意義
    1.8 技術(shù)路線
2 ROC22葉片和莖內(nèi)生固氮菌nifH的檢測(cè)
    2.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備
        2.1.1 試驗(yàn)材料
        2.1.2 主要試驗(yàn)試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 主要試劑的配制
    2.2 方法
        2.2.1 DX120E和E.coil的培養(yǎng)
        2.2.2 DNA的提取
        2.2.3 蛋白質(zhì)的提取
        2.2.4 nifH基因PCR檢測(cè)
        2.2.5 nifH蛋白的Western blot檢測(cè)
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 葉片DNA和蔗莖DNA的提取
        2.3.2 不同引物對(duì)甘蔗葉片和蔗莖nifH基因檢測(cè)
            2.3.2.1 甘蔗葉片nifH基因檢測(cè)結(jié)果
            2.3.2.2 蔗莖nifH基因檢測(cè)結(jié)果
        2.3.3 葉片和莖nifH蛋白的SDS-PAGE電泳
        2.3.4 葉片和蔗莖內(nèi)生固氮菌nifH蛋白的檢測(cè)
            2.3.4.1 葉片內(nèi)生固氮菌nifH蛋白檢測(cè)
            2.3.4.2 莖內(nèi)生固氮菌nifH蛋白檢測(cè)
    2.4 討論
        2.4.1 ROC22葉片和蔗莖內(nèi)生固氮菌nifH基因DNA水平的檢測(cè)
        2.4.2 ROC22葉片和莖中固氮酶nifH鐵蛋白的Western blot檢測(cè)
    2.5 小結(jié)
3 氮肥對(duì)不同甘蔗品種葉片內(nèi)生固氮菌nifH表達(dá)多樣性的影響
    3.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備
        3.1.1 試驗(yàn)材料
        3.1.2 主要試驗(yàn)設(shè)備
        3.1.3 試驗(yàn)主要試劑
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 樣品采集及處理
        3.2.2 甘蔗葉片總RNA的提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄
        3.2.3 甘蔗葉片DNA的提取
        3.2.4 PolyF/PolyR引物在DNA和RNA水平擴(kuò)增葉片nifH基因
        3.2.5 巢式PCR擴(kuò)增甘蔗葉片表達(dá)的nifH基因
        3.2.6 PCR產(chǎn)物的膠回收
        3.2.7 甘蔗葉片nifH基因的克隆
        3.2.8 陽(yáng)性克隆的PCR鑒定
        3.2.9 生物信息學(xué)分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 施氮和不施氮處理不同品種甘蔗葉片總RNA和總DNA的提取
        3.3.2 nifH基因在DNA水平和RNA水平的PCR檢測(cè)
        3.3.3 I引物巢式PCR及nifH基因的克隆
            3.3.3.1 I引物PCR結(jié)果
            3.3.3.2 I引物擴(kuò)增的nifH基因測(cè)序
            3.3.3.3 nifH基因序列比對(duì)（I引物）
            3.3.3.4 nifH基因的系統(tǒng)發(fā)育分析（I引物）
        3.3.4 P引物巢式PCR及nifH基因的克隆
            3.3.4.1 P引物PCR結(jié)果
            3.3.4.2 P引物擴(kuò)增nifH基因測(cè)序
            3.3.4.3 nifH基因序列比對(duì)（P引物）
            3.3.4.4 系統(tǒng)發(fā)育分析（P引物）
    3.4 討論
        3.4.1 固氮菌nifH基因在DNA和RNA水平的檢測(cè)
        3.4.2 用兩對(duì)巢式PCR引物克隆的nifH基因序列
        3.4.3 氮肥對(duì)不同品種甘蔗葉片nifH基因表達(dá)多樣性的影響
    3.5 小結(jié)
4 氮肥對(duì)不同品種甘蔗葉片內(nèi)生固氮菌nifH蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 樣品的采集及處理
        4.2.2 葉片蛋白的提取與Western blot檢測(cè)
        4.2.3 數(shù)據(jù)分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 不同時(shí)期各個(gè)甘蔗樣品葉片總蛋白的提取
        4.3.2 施氮及不施氮處理下不同甘蔗品種葉片內(nèi)生固氮菌nifH鐵蛋白的檢測(cè)
        4.3.3 氮肥對(duì)不同甘蔗品種不同時(shí)期葉片nifH相對(duì)表達(dá)量的影響
            4.3.3.1 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            4.3.3.2 施氮和不施氮處理下不同時(shí)期不同品種nifH蛋白的相對(duì)表達(dá)量
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
5 氮肥對(duì)不同品種甘蔗葉片固氮酶活性的影響
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備及用具
        5.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 樣品乙烯含量測(cè)定
        5.2.2 數(shù)據(jù)分析
    5.3 結(jié)果與分析
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
6 結(jié)論
    6.1 全文總結(jié)
    6.2 論文創(chuàng)新點(diǎn)
    6.3 問題與展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]綠色熒光蛋白基因標(biāo)記的固氮菌DX120E在甘蔗植株內(nèi)的定殖[J]. 魏春燕,邢永秀,莫遙,林麗,楊麗濤,胡春錦,李楊瑞.  作物學(xué)報(bào). 2014(06)
[2]植物內(nèi)生固氮菌在綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)建設(shè)中的應(yīng)用[J]. 何彩梅,吳桂容,唐政,胡月芳.  中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志. 2013(03)
[3]廣西甘蔗根際高效聯(lián)合固氮菌的篩選及鑒定[J]. 胡春錦,林麗,史國(guó)英,汪茜,王錢崧,李楊瑞.  生態(tài)學(xué)報(bào). 2012(15)
[4]玉米內(nèi)生固氮菌的分離鑒定及對(duì)小麥幼苗的促生效應(yīng)[J]. 傅曉方,韓紅江,郝勇鋒,李維平.  西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2012(01)
[5]1株有固氮能力的甘蔗克雷伯氏菌的分離鑒定及固氮特性[J]. 羅霆,歐陽(yáng)雪慶,楊麗濤,李楊瑞.  熱帶作物學(xué)報(bào). 2010(06)
[6]甘蔗內(nèi)生固氮菌液浸種對(duì)甘蔗生長(zhǎng)前期氮代謝相關(guān)酶活性的影響[J]. 歐陽(yáng)雪慶,羅霆,楊麗濤,李楊瑞.  廣西農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(05)
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博士論文
[1]內(nèi)生固氮菌DX120E與甘蔗互作的生理和分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究[D]. 魏春燕.廣西大學(xué) 2016
[2]間作大豆對(duì)甘蔗生長(zhǎng)及內(nèi)生細(xì)菌、固氮細(xì)菌多樣性的效應(yīng)[D]. 楊建波.廣西大學(xué) 2014
[3]甘蔗內(nèi)生固氮細(xì)菌的分離、鑒定和生長(zhǎng)特性[D]. 邢永秀.廣西大學(xué) 2006

碩士論文
[1]施氮水平對(duì)不同甘蔗品種氮素積累利用及產(chǎn)量品質(zhì)的影響[D]. 蔣媛.廣西大學(xué) 2016
[2]甘蔗宿根矮化病病原菌膜蛋白Lxx18460基因的特性研究[D]. 邵敏.廣西大學(xué) 2015
[3]甘蔗內(nèi)生固氮菌Klebsiella variicola DX120E固氮酶基因的克隆和功能分析[D]. 張琨琨.廣西大學(xué) 2015



本文編號(hào)：3137391