氣生根是影響玉米抗倒伏能力的一個重要性狀,在一定程度上決定著玉米的種植密度,與單位面積產量直接相關。玉米氣生根形成不但受關鍵基因決定,而且受microRNA復雜的基因表達調控。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現的一類內源性的具有調控功能的長度約為20-25個核苷酸的非編碼RNA。它們作用于靶基因mRNA的堿基互補區(qū)域,通過剪切降解靶mRNA或抑制靶mRNA轉錄后翻譯實現對基因表達的調控。本研究利用Solexa高通量測序技術對玉米自交系昌7-2（氣生根稀少）和12246（氣生根發(fā)達）進行了microRNA分析,篩選在兩個自交系間氣生根發(fā)育相關的miRNA及其靶基因,并利用實時熒光定量PCR對差異的miRNA及其靶基因進行了驗證。主要研究結果如下:1.Solexa高通量測序在兩個自交系氣生根中分別得到2,549,593和4,186,404個clean讀數,通過分析共發(fā)現屬于27個miRNA家族的202個保守microRNA。2.通過對氣生根發(fā)育保守microRNA分析,得到與氣生根發(fā)育相關的8個miRNA家族的32個保守microRNAs。利用熒光定量PCR的方法對zma... 

【文章來源】：河南農業(yè)大學河南省

【文章頁數】：58 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

植物miRNA生物發(fā)生過程[68]

11圖3Poly(A)聚合酶加尾原理圖[107]Figure3TheprinciplediagramofPoly(A)polymerasetail（1）miRNA加尾RT-PCRmiRNA加尾RT-PCR的原理為：首先poly(A)聚合酶（PAP）改變MaturemiRNA（圖3），使MaturemiRNA的3’端位置加上一段大約4-6個堿基的poly(A)尾巴，然后用5’端含有poly(T)adapter的接頭序列引物進行反轉錄（Reversetranscription），使第一鏈cDNA加上一段序列，為隨后的PCR擴增（PCRamplification）提供反向通用引物序列(Reverseprimer)，再利用一條與miRNA序列特異的正向引物(miRNA-specificforwordprimer)就可實現PCR擴增(PCRproduct)。（2）莖環(huán)引物RT-PCR莖環(huán)引物RT-PCR的原理為：首先設計一條待測miRNA3’端的6-8個互補堿基并且能形成莖環(huán)結構的特異性引物對miRNA進行反轉錄反應，然后用反轉錄的產物作為反應模板進行qPCR擴增（圖4）。Chen等利用莖環(huán)引物RT-PCR的方法比較了5種miRNA在小鼠組織中的差異表達[108]。Lee等也利用該方法進行了人體內細胞、組織和腫瘤中的多種miRNA在不同處理模式下的比較，得到了225種成熟和前體miRNA之間的表達相關性[109]。Feng等在利用莖環(huán)特異性引物對番茄中的7個miRNA進行反轉錄以及相對定量檢測[110]。

12圖4莖環(huán)引物RT-PCR原理圖[121]Figure4Theprinciplediagramofthestem-loopprimerRT-PCR1.3.2.2Northern印跡雜交Northern印跡雜交[112]（Northernblot）是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上的方法。microRNAs常用LNA探針來完成Northern雜交以提高反應過程中的親合性和檢測靈敏度[113]。該方法的基本步驟是：（1）完整mRNA的分離（可以分離長度200nt以下的小RNA）。（2）將RNA轉移到固相支持物上，要注意在轉移的過程中保持RNA在凝膠中的相對分布。（3）固相RNA與標記的寡核苷酸探針雜交。（4）除去非特異結合到固相支持物上的探針分子，對特異結合的探針分子的圖像進行檢測、捕獲和分析。1.4本研究的目的與意義盡管前人關于miRNA調控植物根系生長發(fā)育進行了大量研究[114,115,116]，而其參與氣生根發(fā)育調控的研究報道則相對較少。氣生根對玉米植株具有重要的固定與支撐作用，是決定玉米抗倒伏能力的一個重要性狀，特別是隨著玉米播種密度逐漸增大，植株的根系系統已經成為玉米抗倒伏能力的決定性性狀之一。盡管前人曾經對玉米根系進行了大量研究，多數集中在根系的構型[117,118]、根系的數量[119]等方面，而對氣生根的遺傳機制報道較少。為研究miRNA對玉米氣生根發(fā)育的可能調控機制，本研究選用了兩個玉米自交系昌7-2和12246作為研究材料，其中昌7-2是我國玉米生產上的骨干自交系，來自唐四平頭雜種優(yōu)勢類群，該材料氣生根極少或者沒有氣生根；另一個自交系12246由本課題組利用昌7-2與美國雜交種選系選育的二環(huán)系，該材料具有氣生根發(fā)達的特點，田間一般有3-4層氣生根。本研究通過對兩個自交系的第一節(jié)間氣生根分生組織的miRNA進行高通量測序，研


本文編號：3134117