氣生根是影響玉米抗倒伏能力的一個(gè)重要性狀,在一定程度上決定著玉米的種植密度,與單位面積產(chǎn)量直接相關(guān)。玉米氣生根形成不但受關(guān)鍵基因決定,而且受microRNA復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的長(zhǎng)度約為20-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA。它們作用于靶基因mRNA的堿基互補(bǔ)區(qū)域,通過剪切降解靶mRNA或抑制靶mRNA轉(zhuǎn)錄后翻譯實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。本研究利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)玉米自交系昌7-2（氣生根稀少）和12246（氣生根發(fā)達(dá)）進(jìn)行了microRNA分析,篩選在兩個(gè)自交系間氣生根發(fā)育相關(guān)的miRNA及其靶基因,并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)差異的miRNA及其靶基因進(jìn)行了驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下:1.Solexa高通量測(cè)序在兩個(gè)自交系氣生根中分別得到2,549,593和4,186,404個(gè)clean讀數(shù),通過分析共發(fā)現(xiàn)屬于27個(gè)miRNA家族的202個(gè)保守microRNA。2.通過對(duì)氣生根發(fā)育保守microRNA分析,得到與氣生根發(fā)育相關(guān)的8個(gè)miRNA家族的32個(gè)保守microRNAs。利用熒光定量PCR的方法對(duì)zma... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

植物miRNA生物發(fā)生過程[68]

11圖3Poly(A)聚合酶加尾原理圖[107]Figure3TheprinciplediagramofPoly(A)polymerasetail（1）miRNA加尾RT-PCRmiRNA加尾RT-PCR的原理為：首先poly(A)聚合酶（PAP）改變MaturemiRNA（圖3），使MaturemiRNA的3’端位置加上一段大約4-6個(gè)堿基的poly(A)尾巴，然后用5’端含有poly(T)adapter的接頭序列引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（Reversetranscription），使第一鏈cDNA加上一段序列，為隨后的PCR擴(kuò)增（PCRamplification）提供反向通用引物序列(Reverseprimer)，再利用一條與miRNA序列特異的正向引物(miRNA-specificforwordprimer)就可實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增(PCRproduct)。（2）莖環(huán)引物RT-PCR莖環(huán)引物RT-PCR的原理為：首先設(shè)計(jì)一條待測(cè)miRNA3’端的6-8個(gè)互補(bǔ)堿基并且能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性引物對(duì)miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后用反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物作為反應(yīng)模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增（圖4）。Chen等利用莖環(huán)引物RT-PCR的方法比較了5種miRNA在小鼠組織中的差異表達(dá)[108]。Lee等也利用該方法進(jìn)行了人體內(nèi)細(xì)胞、組織和腫瘤中的多種miRNA在不同處理模式下的比較，得到了225種成熟和前體miRNA之間的表達(dá)相關(guān)性[109]。Feng等在利用莖環(huán)特異性引物對(duì)番茄中的7個(gè)miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以及相對(duì)定量檢測(cè)[110]。

12圖4莖環(huán)引物RT-PCR原理圖[121]Figure4Theprinciplediagramofthestem-loopprimerRT-PCR1.3.2.2Northern印跡雜交Northern印跡雜交[112]（Northernblot）是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。microRNAs常用LNA探針來完成Northern雜交以提高反應(yīng)過程中的親合性和檢測(cè)靈敏度[113]。該方法的基本步驟是：（1）完整mRNA的分離（可以分離長(zhǎng)度200nt以下的小RNA）。（2）將RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上，要注意在轉(zhuǎn)移的過程中保持RNA在凝膠中的相對(duì)分布。（3）固相RNA與標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交。（4）除去非特異結(jié)合到固相支持物上的探針分子，對(duì)特異結(jié)合的探針分子的圖像進(jìn)行檢測(cè)、捕獲和分析。1.4本研究的目的與意義盡管前人關(guān)于miRNA調(diào)控植物根系生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行了大量研究[114,115,116]，而其參與氣生根發(fā)育調(diào)控的研究報(bào)道則相對(duì)較少。氣生根對(duì)玉米植株具有重要的固定與支撐作用，是決定玉米抗倒伏能力的一個(gè)重要性狀，特別是隨著玉米播種密度逐漸增大，植株的根系系統(tǒng)已經(jīng)成為玉米抗倒伏能力的決定性性狀之一。盡管前人曾經(jīng)對(duì)玉米根系進(jìn)行了大量研究，多數(shù)集中在根系的構(gòu)型[117,118]、根系的數(shù)量[119]等方面，而對(duì)氣生根的遺傳機(jī)制報(bào)道較少。為研究miRNA對(duì)玉米氣生根發(fā)育的可能調(diào)控機(jī)制，本研究選用了兩個(gè)玉米自交系昌7-2和12246作為研究材料，其中昌7-2是我國玉米生產(chǎn)上的骨干自交系，來自唐四平頭雜種優(yōu)勢(shì)類群，該材料氣生根極少或者沒有氣生根；另一個(gè)自交系12246由本課題組利用昌7-2與美國雜交種選系選育的二環(huán)系，該材料具有氣生根發(fā)達(dá)的特點(diǎn)，田間一般有3-4層氣生根。本研究通過對(duì)兩個(gè)自交系的第一節(jié)間氣生根分生組織的miRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，研


本文編號(hào)：3134117