本研究是在海島棉再生體系的基礎(chǔ)上以新疆海島棉33號(hào)棉種為材料,獲得胚性愈傷后對(duì)其進(jìn)行Bt基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子檢測(cè)以及室內(nèi)生物測(cè)定,初步確定Bt基因已整合到海島棉品種的基因組中,并對(duì)棉鈴蟲具有一定的抗性作用,結(jié)果如下:切取無菌苗下胚軸為外植體,采用0.1 mg·L^-11 2,4-D和0.1 mg·L^-11 KT激素組合誘導(dǎo)愈傷組織,20 d繼代培養(yǎng)1次,至分化獲得胚性愈傷組織。將攜帶Bt-Cry1A基因的表達(dá)載體pBI121通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到新疆海島棉33號(hào)的胚性愈傷組織中。經(jīng)含有Kan(50 mg·L^-1)和Cef(500 mg·L^-1)的培養(yǎng)基篩選后得到抗性胚性愈傷組織,在KNO₃加倍、NH₄NO₃減為1/4的分化培養(yǎng)基中分化出體細(xì)胞胚,大量減為1/2的培養(yǎng)基中獲得抗性苗,對(duì)獲得的抗性苗采用嫁接的方法以提高成活率,共獲得12棵抗性植株。對(duì)嫁接得到的12棵抗性植株進(jìn)行分子檢測(cè),結(jié)果如下:PCR檢測(cè)結(jié)果顯示... 

【文章來源】：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū)

【文章頁(yè)數(shù)】：61 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

PBI121/Bt-Cry1A表達(dá)載體示意圖

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)的長(zhǎng)面相同，待用。將轉(zhuǎn)基因苗在超凈工作臺(tái)內(nèi)切取上段，將切下來的轉(zhuǎn)基削一長(zhǎng)斜面，長(zhǎng)面的對(duì)側(cè)削一短面，留一至二片葉片，去除多余的葉片作接穗插入待用的砧木切口內(nèi)，使長(zhǎng)削面與砧木的中柱對(duì)齊，短削面緊貼砧使皮層包裹在接穗外面，然后用繩子將其砧木和接穗接觸處綁緊。澆水充分色透明塑料薄膜或者塑料袋將完成嫁接的植株罩住，以防止水分散失。遮陰 d 后逐漸開始通氣，7-10 d后，去掉塑料薄膜或者塑料袋。

A：抗性苗；B：待嫁接的抗性植株；C：白色透明塑料薄膜罩��；D：嫁接成活的抗性植株A：Resistant seedlings；B：The grafted plants to be grafted；C：White transparent plastic film cover；D：Grafted survived resistant plants圖 3-2 抗性植株的嫁接Fig. 3-2 Grafting of resistant plants3.2 轉(zhuǎn)基因植株的 PCR 檢測(cè)采用改良 CTAB 法提取 12 抗性植株的基因組 DNA，并分別利用 Bt 基因特異性引物、GUS 基因特異性引物和 35S Promoter 特異性引物對(duì)抗性植株進(jìn)行 PCR 鑒定。結(jié)果如圖，Bt-F 和 Bt-R 引物可擴(kuò)增出 400 bp 的目的片段（圖 3-3-A），GUS-F 和 GUS-R 可擴(kuò)增出 396 bp 的目的片段（圖 3-3-B），P-F 和 P-R 擴(kuò)增到 277 bp 的目的片段（圖 3-3C），三對(duì)引物均擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小相符的產(chǎn)物，其中陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒擴(kuò)增出了大小相符的片段，而在陰性對(duì)照及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩袥]有目的片段的擴(kuò)增條帶，初步鑒定得到的 12棵抗性植株均為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3111436