基于Stock6來源誘導(dǎo)系的玉米單倍體育種技術(shù)在當(dāng)前已經(jīng)成為快速選育玉米自交系的重要手段,而玉米誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的遺傳學(xué)基礎(chǔ)及生物學(xué)機(jī)理仍不清楚。本研究主要圍繞玉米單倍體誘導(dǎo)相關(guān)QTL精細(xì)定位、誘導(dǎo)基因克隆與功能驗(yàn)證、高油型玉米單倍體誘導(dǎo)系選育及玉米單倍體誘導(dǎo)過程中的異雄核籽粒發(fā)生機(jī)制進(jìn)行探究。本研究的主要結(jié)論如下:1)在控制誘導(dǎo)率的主效QTL精細(xì)定位研究的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了誘導(dǎo)系材料CAU5的BAC文庫,通過陽性克隆篩選及測序分析,獲得了該區(qū)段的BAC序列。并根據(jù)序列比對與功能注釋,在該區(qū)段內(nèi)13個基因中確定了編碼磷脂酶（ZmPL41）的基因?yàn)楹蜻x基因。通過CRISPR/Cas9定點(diǎn)突變技術(shù)將野生型玉米材料的ZmPLA1基因突變后,使其獲得了單倍體誘導(dǎo)能力,說明該基因的突變就是導(dǎo)致Stock6來源誘導(dǎo)系誘導(dǎo)玉米單倍體產(chǎn)生的原因。2)通過測序發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)系中基因Zmpla1與B73的ZmPLA1序列在外顯子上共存在11個單堿基替換突變和1個4bp插入突變。本研究利用50個不同來源自交系的ZmPLA1基因測序分析結(jié)果證明,4bp插入是導(dǎo)致玉米單倍體誘導(dǎo)功能產(chǎn)生的原因。RNA-seq數(shù)據(jù)表明,相比... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖２－３磷脂酶編碼基因ＧＲＭＺＭ２?

編碼乙酰??轉(zhuǎn)移酶基因ＧＲＭＺＭ５Ｇ８６６７５８的第一外顯子處設(shè)計靶位點(diǎn)，構(gòu)建了?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９載體。對構(gòu)建??成功的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９載體進(jìn)行突變效率檢測，將ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９載體轉(zhuǎn)化到玉米葉片原生質(zhì)體中，??提取原生質(zhì)體ＤＮＡ，將目的片段擴(kuò)增出來進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果表明，在未轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體中，??其ＰＣＲ產(chǎn)物均能夠被內(nèi)切酶ＴＶｃｏ／切開，說明該酶切序列沒有發(fā)生變異，而在轉(zhuǎn)化??ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的處理中，ＰＣＲ產(chǎn)物大部分均不能被內(nèi)切酶＆ｗ９＜５／／Ａ／ｃｏ／切幵（圖２－４），因此說明，??在酶切位點(diǎn)發(fā)生了序列變異，導(dǎo)致變異后的序列不能被識別。為進(jìn)一步證明靶位點(diǎn)的序列發(fā)生了、??變異，對ＰＣＲ產(chǎn)物純化后連入Ｔ１載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行單克隆測序，測序結(jié)果表明，相對??于正常的序列，部分ＰＣＲ產(chǎn)物確實(shí)發(fā)生了序列的變異（圖２－５），其中有的發(fā)生了?１個ｂｐ的缺失，??有的發(fā)生了?４個ｂｐ的缺失。從而證明了該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)的突變能力。??ＧＲＭＺＭ２Ｇ４７１２４０??２?－?＋??—??圖２－４轉(zhuǎn)化后原生質(zhì)體基因突變效率檢測??Ｆｉｇｕｒｅ?２－４?Ｍｕｔａｎｔｉｏｎ?ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９??１８??

戶國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文?第二章勸／＞／候選基因的克隆與功能驗(yàn)證??ＣＳ２－１９?雙峰?缺失?１?（Ｃ）或插入?１（Ａ）或缺失?１３ｂｐ?ＴＧＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡ??ＣＳ２－２８?雙峰?插入?１?（Ｃ）或缺失?ｌｌｂｐ?ＡＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣ??ＣＳ２－３１?雙峰?缺失２６ｂｐ???ＣＳ３－１７?雙峰?４ｂｐ缺失???２．２．５轉(zhuǎn)基因材料的表型鑒定??１?？?突變后能夠顯著提高胚乳敗育籽粒頻率??Ｉ?Ｉ?ｉｆ?§?Ｉ??［?ｋｍ?Ｊｍ?Ａ??圖２－６轉(zhuǎn)基因果穗與對照（Ａ圖為野生型受體材料自交的果穗，Ｂ圖為ＺｍＰＬＺ／突變后自交的果穗。）??Ｆｉｇｕｒｅ?２－６?ｅａｒｓ?ｐｅｒｆｏｎｎａｎｃｅ?ｏｆ?ＺｍＰＬＡｌ?Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ?ｌｉｎｅ?ａｎｄ?ｗｉｌｄｔｙｐｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?（ｌｅｆｔ：?ｅａｒｓ?ｏｆ?ｗｉｌｄｔｙｐｅ，?ｒｉｇｈｔ：?ｅａｒｓ?ｏｆ??ＺｍＰＬＡｌ?ＩＣｎｏｃｋ－ｏｕｔ?ｌｉｎｅ）??在２０１６年５月獲得的Ｚｍｐ／ｄ轉(zhuǎn)基因果穗中發(fā)現(xiàn)了少量的胚乳敗育的情況，但是由于果穗的??數(shù)量較少，且溫室內(nèi)獲得的果穗上本身也有一定頻率的敗育籽粒，因此不能確定是由于溫室環(huán)境??引起的還是基因突變造成的。但是在基因ＧＲＭＺＭ５Ｇ８６６７５８的突變體材料中發(fā)現(xiàn)敗育較少。推??測可能是導(dǎo)致單倍體產(chǎn)生的候選基因。為進(jìn)一步驗(yàn)證，２０１６年６月在通州種植了?Ｔ，代轉(zhuǎn)??基因材料，為保證有充分的測驗(yàn)量，每個轉(zhuǎn)基因家系種植至少１０棵。在自交的果穗中發(fā)現(xiàn)，??基因突變后，在果穗上有顯著多的胚乳敗育籽粒（圖２－６Ｂ）。而在對照材料和ＧＲＭＺＭ５Ｇ８６６７５８??的突變體中，并沒有發(fā)現(xiàn)胚乳敗育籽粒頻率提高（圖

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]不同播期對玉米單倍體自然加倍效果的影響[J]. 王文潔,周聯(lián)東,劉經(jīng)緯,孫佩,王蕊.  河南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2015(01)
[2]作物育種工程化與工程化育種思考[J]. 陳紹江.  作物雜志. 2013(06)
[3]玉米單倍體在黑龍江與海南自然加倍效果的對比研究[J]. 蔡泉,曹靖生,史桂榮,郭曉明,張建國,趙偉,李樹軍,殷躍.  玉米科學(xué). 2012(05)
[4]玉米單倍體核磁共振自動分揀系統(tǒng)的開發(fā)(英文)[J]. 劉金,郭婷婷,楊培強(qiáng),汪紅志,劉利榮,陸治勇,徐小萍,胡靖麗,黃清明,陳紹江.  農(nóng)業(yè)工程學(xué)報. 2012(S2)
[5]玉米單倍體在春夏不同播期條件下的自然加倍效果研究[J]. 蘆連勇,王海莉,董文恒,宋俊喬.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2012(18)
[6]玉米單倍體育種研究進(jìn)展[J]. 杜何為,戴景瑞,李建生.  玉米科學(xué). 2010(06)
[7]花藥離體培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 王茂良,馮慧.  北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報. 2010(03)
[8]玉米自交系選育的理論基礎(chǔ)與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)[J]. 張銘堂,徐國良,才卓.  玉米科學(xué). 2010(02)
[9]玉米單倍體育種研究進(jìn)展[J]. 才卓,徐國良,張銘堂,路明.  玉米科學(xué). 2008(01)
[10]利用高油分的花粉直感效應(yīng)鑒別玉米單倍體[J]. 陳紹江,宋同明.  作物學(xué)報. 2003(04)

博士論文
[1]玉米單倍體誘導(dǎo)效應(yīng)分析與機(jī)器學(xué)習(xí)在DH技術(shù)中的應(yīng)用[D]. 李偉.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]玉米單倍體誘導(dǎo)基因qhir1精細(xì)定位與新型誘導(dǎo)系選育研究[D]. 董昕.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[3]玉米生物誘導(dǎo)單倍體雄穗育性恢復(fù)研究[D]. 吳鵬昊.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014



本文編號：3099282