發(fā)布時間：2020-11-09 19:07

　　 決明(Cassia obtusifolia L)為一年生豆科植物,干燥成熟的種子被稱為決明子,含有較高的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑。隨著對決明功能基因的研究,已從決明種子中成功分離出Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因決明胰蛋白酶抑制劑基因1與決明胰蛋白酶抑制劑基因2(Cassia obtusifolia 1,COTI1和Cassia obtusiflia 2,COTI2),通過體內(nèi)、體外實驗以及轉(zhuǎn)基因擬南芥過表達進一步研究了目的基因的抗蟲及抗逆性,為提高植物抗蟲、抗逆方面的研究奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1)決明胰蛋白酶抑制劑1(COTI1)通過原核表達純化,將純化蛋白COTI1喂食菜青蟲,發(fā)現(xiàn)喂食COTI1的幼蟲比正常組幼蟲生長緩慢,甚至出現(xiàn)死亡情況。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)對照組和COTI1喂食組中腸中與消化解毒相關(guān)基因出現(xiàn)差異表達,對照組中腸消化解毒基因的RPKM值與相對表達量均明顯高于COTI1喂食組,表明COTI1抑制了中腸消化解毒酶的活性,從而達到抗蟲作用,這為后續(xù)植物抗蟲以及抗蟲生物制劑研究奠定了基礎(chǔ)。2)以已克隆出的決明胰蛋白酶抑制劑2(COTI2)基因全長序列(792bp)為基礎(chǔ),構(gòu)建COTI2-pBI121真核表達載體,通過凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101,擴大培養(yǎng)�；ㄐ蚪緦OTI2轉(zhuǎn)入擬南芥,經(jīng)卡那霉素篩選后得到轉(zhuǎn)COTI2基因陽性苗。3)擬南芥苗移植于含100mM、150mM NaCl以及1%、2%PEG的1/2MS瓊脂平板上脅迫生長,觀察到轉(zhuǎn)COTI2基因擬南芥生長狀態(tài)比野生型生長得更為茁壯,總根長、側(cè)根長以及側(cè)根密度都明顯優(yōu)于野生型擬南芥。利用根系掃描分析儀WinRHIZO測定分析得出:干旱脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因擬南芥?zhèn)雀L度為野生型的1.246倍;鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因是野生型的1.577倍。其次,轉(zhuǎn)COTI2基因擬南芥種子在2%、3%PEG脅迫下萌發(fā)率分別為53%與24%,野生型種子的萌發(fā)率為45%、11%;在100mM、150mM NaCl脅迫下,轉(zhuǎn)COTI2基因擬南芥種子萌發(fā)率為84.7%與26.7%,而野生型擬南芥種子萌發(fā)率為76%與18%。由此可見,與野生型比較,轉(zhuǎn)COTI2基因擬南芥種子在干旱和鹽脅迫條件下,有更高的萌發(fā)率。4)轉(zhuǎn)COTI2基因苗與野生型苗移栽到營養(yǎng)土中培育,并用100mM、150mM NaCl和2%、3%PEG進行鹽和干旱脅迫,100m M NaCl模擬鹽脅迫8天后,測得轉(zhuǎn)基因擬南芥的植株高度是野生型擬南芥的150%;150mM NaCl模擬鹽脅迫4天后,轉(zhuǎn)基因擬南芥的植株高度是野生型擬南芥的128%;采用2%PEG模擬干旱迫8天后,轉(zhuǎn)基因的植株高度是野生型的111%;3%PEG模擬干旱脅迫4天后,轉(zhuǎn)基因是野生型的114%。土培脅迫下,轉(zhuǎn)COTI2基因擬南芥的植株高度明顯高于野生型擬南芥植株,且生長狀態(tài)更好。同時,測得葉片相對含水量:100mM NaCl脅迫8天,轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片相對含水量是野生型擬南芥的108%;150mM NaCl脅迫4天后,轉(zhuǎn)基因是野生型的104%;2%PEG模擬干旱迫8天,轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片相對含水量是野生型擬南芥的109%;3%PEG脅迫4天后,轉(zhuǎn)基因是野生型的105%,轉(zhuǎn)COTI2基因擬南芥的保水能力高于野生型。5)RT-qPCR結(jié)果顯示:COTI2基因在不同脅迫下出現(xiàn)差異表達,1%PEG脅迫時相對表達量最高,隨后降低,而在鹽脅迫時表達量隨NaCl濃度的升高出現(xiàn)上升趨勢。而相較于無脅迫時,COTI2在鹽與干旱脅迫時均具有更高的相對表達量。6)同時,測定不同脅迫時擬南芥粗蛋白對胰蛋白酶的抑制活性,結(jié)果顯示無脅迫時轉(zhuǎn)COTI2基因擬南芥蛋白的抑制活性比是野生型擬南芥的1.37倍,而干旱脅迫和鹽脅迫時轉(zhuǎn)基因粗蛋白的抑制活性比分別是野生型的2.54倍與1.80倍,轉(zhuǎn)COTI2基因擬南芥粗蛋白對胰蛋白酶的抑制活性明顯高出野生型擬南芥,表明COTI2蛋白對胰蛋白酶(EC3.4)等絲氨酸蛋白酶的活性有明顯的抑制作用,在植株抗逆應(yīng)激反應(yīng)等方面有重要作用。7)對脅迫處理后的擬南芥根系進行轉(zhuǎn)錄組測序分析,鹽與干旱脅迫下,轉(zhuǎn)COTI2基因擬南芥與野生型擬南芥中與抗逆相關(guān)的基因出現(xiàn)明顯差異表達,其中轉(zhuǎn)基因中的Hsp20、Hsf及R蛋白表達量在干旱脅迫下出現(xiàn)明顯上調(diào),提高了植物抗干旱的能力。同時,耐鹽蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶以及Kunitz胰蛋白酶抑制劑在鹽脅迫時的表達量也顯著升高,提高了擬南芥植株的抗鹽能力,表明轉(zhuǎn)COTI2基因擬南芥相較于野生型具有更高的抗逆能力。8)首次構(gòu)建了真核表達載體COTI2-pYES2轉(zhuǎn)入釀酒酵母BY4741,并篩選鑒定得到陽性克隆,成功將目的基因轉(zhuǎn)入酵母表達系統(tǒng),為后續(xù)蛋白功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：西南交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2;S567.219
【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 決明簡介
        1.1.1 決明生物學(xué)特征
        1.1.2 決明子的主要活性成分
    1.2 胰蛋白酶抑制劑的研究進展
        1.2.1 胰蛋白酶抑制劑簡介
        1.2.2 胰蛋白酶抑制劑分類
        1.2.3 胰蛋白酶抑制劑的研究進展
    1.3 胰蛋白酶抑制劑的應(yīng)用
        1.3.1 農(nóng)業(yè)和養(yǎng)植方面的應(yīng)用
        1.3.2 臨床應(yīng)用
    1.4 研究意義及內(nèi)容
第2章 COTI1的抗蟲效用及對中腸相關(guān)基因表達模式的影響
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 動物材料
        2.1.3 其他試劑
    2.2 試驗方法
        2.2.1 蛋白COTI1的表達
        2.2.2 蛋白COTI1的純化及濃度測定
        2.2.3 COTI1蛋白對菜青蟲生長發(fā)育的影響
        2.2.4 COTI1蛋白對牛胰蛋白酶及中腸蛋白酶的抑制活性
        2.2.5 中腸RNA提取及cDNA合成
        2.2.6 特異性引物的設(shè)計
        2.2.7 中腸消化解毒相關(guān)基因的RT-qPCR擴增
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 蛋白COTI1的表達
        2.3.2 蛋白COTI1的純化及濃度測定
        2.3.3 COTI1蛋白對菜青蟲的生長發(fā)育及中腸酶的抑制
        2.3.4 中腸組織RNA的提取
        2.3.5 引物特異性檢測
        2.3.6 中腸相關(guān)基因表達模式分析
    2.4 本章小結(jié)
第3章 轉(zhuǎn)COTI2基因擬南芥的獲得
    3.1 實驗材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 其他試劑及菌種
    3.2 試驗方法
        3.2.1 重組真核表達載體的提取
        3.2.2 重組農(nóng)桿菌GV3101的構(gòu)建
        3.2.3 野生型擬南芥的種植
        3.2.4 轉(zhuǎn)染野生型擬南芥
        3.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性苗的篩選
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 重組真核表達載體的提取與鑒定
        3.3.2 重組農(nóng)桿菌GV3101的構(gòu)建
        3.3.3 野生型擬南芥的種植
        3.3.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性苗的篩選
    3.4 本章小結(jié)
第4章 擬南芥的萌發(fā)率和側(cè)根生長情況
    4.1 實驗材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 其他試劑
    4.2 試驗方法
        4.2.1 培養(yǎng)基的配置
        4.2.2 種子的萌發(fā)
        4.2.3 幼苗脅迫處理
        4.2.4 表型觀察以及根系分析
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 種子的萌發(fā)率
        4.3.2 幼苗脅迫表型觀察
        4.3.3 脅迫條件下側(cè)根分析
    4.4 本章小結(jié)
第5章 擬南芥土培脅迫表型及葉片相對含水量
    5.1 實驗材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 其他試劑
    5.2 實驗方法
        5.2.1 種子的春化及萌發(fā)
        5.2.2 幼苗的移植培養(yǎng)
        5.2.3 植株脅迫處理
        5.2.4 擬南芥葉片相對含水量測定
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 擬南芥鹽脅迫表型分析
        5.3.2 擬南芥干旱脅迫表型分析
        5.3.3 擬南芥葉片的相對含水量
    5.4 本章小結(jié)
第6章 COTI2基因在不同脅迫下表達模式
    6.1 實驗材料
        6.1.1 植物材料
        6.1.2 其他試劑
    6.2 試驗方法
        6.2.1 擬南芥樣本獲取
        6.2.2 RNA提取與cDNA的合成
        6.2.3 特異性引物的設(shè)計與檢測
        6.2.4 擬南芥COTI2基因的RT-qPCR擴增
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥RNA提取
        6.3.2 特異性引物檢測
        6.3.3 COTI2基因的表達模式分析
    6.4 本章小結(jié)
第7章 擬南芥蛋白抑制活性測定
    7.1 實驗材料
        7.1.1 植物材料
        7.1.2 其他試劑
    7.2 試驗方法
        7.2.1 擬南芥葉片總蛋白的提取
        7.2.2 蛋白濃度的測定
        7.2.3 蛋白抑制活性的測定
    7.3 結(jié)果與討論
        7.3.1 擬南芥粗蛋白濃度
        7.3.2 擬南芥粗蛋白的抑制活性
    7.4 本章小結(jié)
第8章 擬南芥的轉(zhuǎn)錄組分析
    8.1 實驗材料
        8.1.1 植物材料
        8.1.2 其他試劑
    8.2 試驗方法
        8.2.1 樣品的獲取
        8.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序及分析
    8.3 結(jié)果與討論
        8.3.1 干旱脅迫下轉(zhuǎn)COTI2基因與野生型的差異表達基因
        8.3.2 鹽脅迫下轉(zhuǎn)COTI2基因與野生型的差異表達基因
    8.4 本章小結(jié)
第9章 COTI2酵母表達系統(tǒng)的構(gòu)建
    9.1 實驗材料
        9.1.1 實驗試劑
        9.1.2 菌種與質(zhì)粒
    9.2 實驗方法
        9.2.1 含酶切位點的引物設(shè)計
        9.2.2 加酶切位點
        9.2.3 真核表達載體構(gòu)建
        9.2.4 轉(zhuǎn)化釀酒酵母 BY4741
    9.3 結(jié)果與討論
        9.3.1 加酶切位點及雙酶切
        9.3.2 真核表達載體構(gòu)建及雙酶切鑒定
        9.3.3 轉(zhuǎn)化釀酒酵母
    9.4 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及科研成果

【參考文獻】

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