在食品加工過程中,以蕎麥尤其是苦蕎麥為原料制備的食品存在一定的苦澀味,嚴(yán)重影響口感,降低了蕎麥的利用價值。蘆丁水解酶(rutin-hydrolyzing enzyme,RHE)通過水解蘆丁生成的槲皮素是其苦澀味產(chǎn)生的主要原因。因此,若將苦蕎蘆丁水解酶基因(Fagopyrum tartaricum rutin-hydrolyzing enzyme,FtRHE)敲除,則有可能獲得無苦澀味的蕎麥,更加有利于蕎麥的利用及推廣。盡管國內(nèi)外在蘆丁水解酶的性質(zhì)、底物特異性等方面已經(jīng)做了一些的研究,但是迄今為止還未見RHE的DNA序列的相關(guān)報道。本課題組從苦蕎轉(zhuǎn)錄組中克隆得到蘆丁水解酶基因FtRHE并在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)研究。主要完成以下研究內(nèi)容:1.FtRHE基因的序列鑒定。為獲得苦蕎麥中FtRHE基因,以云蕎1號苦蕎種子為材料,制備獲得天然RHE,通過MALDI-TOF/TOF-MS鑒定天然RHE序列信息,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選FtRHE。結(jié)果顯示,純化的天然RHE分子量約為62 kD,肽質(zhì)量指紋圖譜證明其為一種β-葡萄糖苷酶,質(zhì)荷比為914.4286的肽段FSISWSR為其特征肽段。在苦蕎種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得FtRHE基因序列基礎(chǔ)上,通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得了苦蕎蘆丁水解酶基因FtRHE。FtRHE開放閱讀框由1539個堿基組成,編碼512個氨基酸,1-29位氨基酸為其信號肽。多重序列比對表明RHE與有物種差別的β-葡萄糖苷酶氨基酸保守性不是特別高,同源性普遍集中在54%—62%之間。由生物化學(xué),分子生物學(xué)方法結(jié)合軟件分析發(fā)現(xiàn),RHE分子中有4個疏水區(qū);它的二級結(jié)構(gòu)由48.44%無規(guī)則卷曲、37.30%α-螺旋和14.26%β-折疊組成;其結(jié)構(gòu)域含有與糖苷水解酶家族1相同的(β/α)8TIM桶狀結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步根據(jù)蘆丁水解酶相關(guān)結(jié)構(gòu)預(yù)測,發(fā)現(xiàn)其活性位點(diǎn)可能是第200位的谷氨酸和第412位的谷氨酸。2.FtRHE基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及表達(dá)。為了獲得與天然RHE相同生物學(xué)活性的重組型RHE,為后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ),我們首先構(gòu)建了FtRHE的原核表達(dá)載體,其中包括PRSETC、pGEX-4T-1、pET-32a這些在大腸桿菌中表達(dá)的載體,并通過測序鑒定正確再進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果未發(fā)現(xiàn)特異條帶。我們嘗試基于大腸桿菌的密碼子偏好優(yōu)化序列,去掉信號肽區(qū)域表達(dá)仍未成功。因此,改用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),首先構(gòu)建真核表達(dá)載體,通過轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建Bacmid-FtRHE重組桿粒,轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9后,成功表達(dá)了具有較高蘆丁水解酶活性的重組FtRHE。酶活測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,我們表達(dá)的FtRHE與苦蕎中天然提取的RHE活性類似。該研究為高含量蘆丁及無苦澀味蕎麥育種以及由蘆丁生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)槲皮素等的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S517;Q943.2
【部分圖文】：

第二章 FtRHE 基因的序列鑒定ro 8.5、Microsoft Office Excel 2003、Photosho白膠以及核酸膠圖進(jìn)行圖像處理。酶制備蘆丁降解酶在蕎麥中存在多種同工酶[39]，從小，催化性質(zhì)等方面也不同。因此，本文在取，RHE 基因克隆等實(shí)驗(yàn)，均采用云蕎 1 號法，成功純化了該蛋白，SDS-PAGE 分析顯示的 nRHE 與唐宇等從野生金蕎麥籽粒中純化定，純化的蛋白可以將天然底物蘆丁脫去蕓分之九十五以上。表明純化的蛋白具有蘆丁鑒定實(shí)驗(yàn)。

苦蕎蘆丁水解酶的序列鑒定及表達(dá)純化萄糖苷酶。PMF 質(zhì)荷比為 914.4286 在很多的糖苷酶中均被發(fā)現(xiàn)，說明該 2712.1331 的肽段 ALDFMFGWFANPIi/356557126, vicianin beta-glucosidase, G肽段IANGTTGDVADDFYHR被鑒定glucosidase 12,Ananas comosus） 序列萄糖苷酶。隆們獲得了分子量約為 1600 bp 的條帶（asy 載體連接，經(jīng)測序確定其基因序列基組成，編碼 512 個氨基酸，預(yù)測的分庫登錄，登錄號為：2055990。

第二章 FtRHE 基因的序列鑒定列 TVSRSSFPDGFLFGL 同源性更高[34]，因此 1-29 位氨基酸更有可能為其苦蕎麥中的 RHE 與 GenBank 中選取的其它物種來源，且功能明確的β-葡，用 Clustal W 對其進(jìn)行多重序列比對，發(fā)現(xiàn)該基因在各物種間的保守性不，相似性普遍集中在 54%-62%之間。如 Fig. 2.4 所示，不同來源的β-葡萄糖號肽序列保守性都比較差，其它氨基酸序列的保守性相對較高。多肽序列 F不同來源的β-葡萄糖苷酶序列都完全一致。經(jīng) MALDI-TOF/TOF-MSLDFMFGWFANPITFGDYPESMR 和 IANGTTGDVADDFY HR 在不同來源糖苷酶中序列保守性也較高。但是這兩個肽段在 FtRHE 基因編碼的氨基酸不完全一致，原因可能是蕎麥中存在多種同工酶所致。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2862748