目的:本實(shí)驗(yàn)以遼寧省不同栽培產(chǎn)地中藥龍膽草及其種子、幼苗為研究對(duì)象,對(duì)龍膽草質(zhì)量及種子幼苗逆境脅迫適應(yīng)性進(jìn)行研究,以期為建立龍膽藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)及更為規(guī)范化的龍膽種植提供依據(jù)。材料與方法:1材料:本課題實(shí)驗(yàn)材料采集于遼寧省3個(gè)不同栽培產(chǎn)地及各產(chǎn)地不同基地的龍膽草共14批(遼寧省撫順市清原縣,撫順市新賓縣,本溪市桓仁縣),藥用部位為其根及根莖。經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)尹海波教授鑒定為粗糙龍膽Gentiana scabra Bunge;龍膽草種子和兩年生幼苗采集于撫順市清原縣英額門鎮(zhèn)英額門村,品種皆為粗糙龍膽Gentiana scabra Bunge。實(shí)驗(yàn)用土壤樣品采集于與14批藥材對(duì)應(yīng)的栽培基地。2方法:2.1采用培養(yǎng)皿紙上發(fā)芽法,利用不同濃度PEG6000、分析純NaCl人工營造水分脅迫和鹽分脅迫環(huán)境,在此基礎(chǔ)上測(cè)定種子發(fā)芽率,發(fā)芽勢(shì),發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo),采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn),比較脅迫環(huán)境下種子萌發(fā)指標(biāo)與正常生長環(huán)境的差異。2.2通過查閱文獻(xiàn),篩選出6種可以緩解干旱脅迫傷害的外源物質(zhì),分別為CaCl_2,水楊酸,殼聚糖,SNP,亞精胺,甜菜堿。采用培養(yǎng)皿紙上發(fā)芽法,利用PEG6000人工營造干旱脅迫環(huán)境,外源添加不同濃度的6種外源物質(zhì),采用顯著性差異檢驗(yàn)法(LSD法)分析結(jié)果。2.3組培室內(nèi)培養(yǎng)兩年生龍膽幼苗5周,期間正常灌水,后采用盆栽控水法進(jìn)行干旱脅迫處理,將不同濃度殼聚糖溶液注射于脅迫處理組的幼苗根部,期間測(cè)定葉片葉綠素含量;培養(yǎng)6周后采集幼苗根及根莖,烘干粉碎后采用高效液相色譜法測(cè)定其裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類含量。2.4采用高效液相色譜法測(cè)定不同栽培產(chǎn)地龍膽草藥材中裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類,即龍膽苦苷,獐牙菜苦苷,獐牙菜苷,苦龍膽酯苷的含量,測(cè)定對(duì)應(yīng)產(chǎn)地土壤中重金屬及農(nóng)殘含量,計(jì)算采樣后藥材折干率,綜合評(píng)價(jià)龍膽藥材質(zhì)量。結(jié)果:1.試驗(yàn)相關(guān)分析表明龍膽種子的發(fā)芽率與NaCl濃度之間呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān),種子發(fā)芽勢(shì),發(fā)芽指數(shù),幼苗長度,活力指數(shù)均隨著NaCl的增大呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì),龍膽種子在萌發(fā)期間鹽脅迫的適宜值為13.15 mmol/L,臨界值為71.06mmol/L,極限值為128.97 mmol/L;當(dāng)PEG濃度為5%時(shí),龍膽種子的發(fā)芽率,發(fā)芽勢(shì),發(fā)芽指數(shù)均較對(duì)照組有小幅度的上升,10%濃度組的發(fā)芽率,根莖比,幼苗長度與對(duì)照組比無顯著性差異,15%-20%濃度組發(fā)芽率,根莖比與對(duì)照組比有極顯著性差異(P0.01)。2.15%PEG干旱脅迫顯著抑制種子萌發(fā),6種外源物質(zhì)皆可在一定程度上緩解干旱脅迫帶來的傷害。其中以甜菜堿625mg/L,殼聚糖25mg/L,SNP 0.7mmol/L,水楊酸10mg/L,氯化鈣5 mmol/L,亞精胺0.01mmol/L濃度為最佳。3.干旱脅迫環(huán)境下龍膽幼苗內(nèi)指標(biāo)性成分龍膽苦苷含量較正常水分對(duì)照組高,葉片葉綠素含量低于正常水分對(duì)照組;殼聚糖4組濃度處理組龍膽苦苷含量皆比正常水分對(duì)照組高,葉綠素含量低于正常水分對(duì)照組,高于干旱脅迫對(duì)照組。其中150 mg/L的殼聚糖濃度處理組龍膽苦苷含量基本與干旱對(duì)照組持平,為3.91%,故殼聚糖溶液以150 mg/L為最佳濃度。4.含量測(cè)定結(jié)果表明龍膽苦苷含量整體趨勢(shì)為桓仁縣新賓縣清原縣,但結(jié)果經(jīng)SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析顯示無顯著性差異(P0.05)。清原縣各栽培基地之間龍膽苦苷含量除基地5和基地8外整體差異不明顯,基地5,基地8含量較高。5.農(nóng)殘及重金屬含量測(cè)定結(jié)果顯示3個(gè)遼寧栽培產(chǎn)地銅、鉛、汞、砷4種重金屬含量均符合國家重金屬限量標(biāo)準(zhǔn),清原縣4、5、6、8栽培基地藥材中未檢測(cè)出汞元素,所有栽培產(chǎn)地土壤中均未檢測(cè)出鎘元素,而所有基地藥材均檢測(cè)出Cd元素,新賓縣及清原縣2-2基地藥材中檢測(cè)出2-苯基苯酚,其含量超過歐盟標(biāo)準(zhǔn)(No 396/2005第12章)。6.清原縣灣甸子鎮(zhèn)大冰溝栽培基地藥材的折干率最高,為41.22%,英額門鎮(zhèn)英額門村栽培基地藥材折干率平均為40.51%,桓仁縣五里甸村藥材折干率為38.03%,北甸子鄉(xiāng)藥材折干率39.67%,新賓縣藥材折干率40.95%。結(jié)論:1.龍膽種子體積較小,正常情況下保存期限只有一年左右。本課題首次研究了粗糙龍膽種子在水分脅迫和鹽分脅迫環(huán)境下的萌發(fā)規(guī)律,結(jié)果證明龍膽種子在適度的干旱脅迫下其各萌發(fā)指標(biāo)呈上升趨勢(shì),說明適度干旱脅迫反而可以促進(jìn)種子萌發(fā);鹽分脅迫采用了分析純氯化鈉人工營造鹽分脅迫環(huán)境,結(jié)果顯示龍膽種子的發(fā)芽率與NaCl濃度之間呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān),各萌發(fā)指標(biāo)均隨著氯化鈉濃度的提高顯著下降,說明龍種子適度耐旱而極其不耐鹽,應(yīng)嚴(yán)格預(yù)防栽培產(chǎn)地的土壤鹽漬化,合理灌溉,合理施肥,確保龍膽栽培產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。2.有研究發(fā)現(xiàn)某些外源物質(zhì)可以緩解逆境脅迫給植物帶來的傷害。通過查閱文獻(xiàn),篩選出6種外源物質(zhì),殼聚糖,水楊酸,亞精胺,甜菜堿,氯化鈣,硝普鈉,在干旱脅迫環(huán)境下研究其對(duì)種子萌發(fā)的影響,結(jié)果證明6種外源物質(zhì)均可在一定程度上提高干旱逆境脅迫下種子的發(fā)芽率及其它萌發(fā)指標(biāo),證實(shí)了其緩解干旱脅迫能力的有效性。3.幼苗干旱脅迫適應(yīng)性研究表明,干旱脅迫抑制了幼苗葉片葉綠素的合成,但是促進(jìn)了根及根莖次生代謝產(chǎn)物龍膽苦苷的積累,殼聚糖可緩解干旱逆境給幼苗帶來的傷害,高濃度殼聚糖與干旱脅迫協(xié)同促進(jìn)了龍膽苦苷的累積。4.從藥材折干率,指標(biāo)性成分含量,重金屬農(nóng)殘檢測(cè)結(jié)果綜合來看,清原縣灣甸子鎮(zhèn)栽培龍膽的質(zhì)量較高,但應(yīng)警戒Cd元素超標(biāo)的問題,加強(qiáng)土地的清潔度管理。
【學(xué)位單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S567.239
【部分圖文】：

圖 2 PEG 對(duì)龍膽種子累計(jì)發(fā)芽率的影響3.3 水分脅迫對(duì)龍膽種子發(fā)芽勢(shì)，發(fā)芽指數(shù)的影響由表 1 可知，PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在 0-5%范圍內(nèi)，龍膽種子的發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢(shì)呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，而后隨著 PEG 濃度的加大，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)逐步降低。對(duì)照組和 5%濃度組的種子日發(fā)芽數(shù)在第 8 天達(dá)到最高，故兩組種子的發(fā)芽勢(shì)定在第 8 天，分別為 34.67%和 36.67%。10%濃度組種子的發(fā)芽勢(shì)定在第 10 天，為28%，15%濃度組發(fā)芽勢(shì)延遲到第 12 天，為 24.67%.由此可見，PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的加大，會(huì)導(dǎo)致發(fā)芽勢(shì)天數(shù)的延后，減弱種子的萌發(fā)能力。其中 5%，10%濃度組種子的發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照組相比無顯著性差異，15%濃度組與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05），20%濃度組與對(duì)照組比較有極顯著性差異（P＜0.01）。說明此時(shí) PEG 濃度超過了龍膽種子萌發(fā)過程的滲透調(diào)節(jié)承受限度，對(duì)種子的萌發(fā)和

圖 3 NaCl 脅迫對(duì)龍膽種子發(fā)芽率的影響4.2 NaCl 脅迫對(duì)龍膽種子相對(duì)發(fā)芽率的影響為進(jìn)一步研究龍膽種子的耐鹽程度，將相對(duì)發(fā)芽率與相對(duì)應(yīng)的鹽濃度之間進(jìn)行相關(guān)回歸分析，如圖 4，結(jié)果表明，NaCl 脅迫下的相對(duì)發(fā)芽率隨鹽溶液濃度的升高而降低，相對(duì)發(fā)芽率與 NaCl 溶液濃度表現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為 0.8510，回歸方程為：y=-19.427x+100.10。以相對(duì)發(fā)芽率的 75%、50%、25%時(shí)所對(duì)應(yīng)的 NaCl 濃度作為龍膽種子發(fā)芽時(shí)鹽脅迫的適宜值、臨界值和極限值。得出 NaCl 脅迫時(shí)，龍膽種子在萌發(fā)期間鹽脅迫的適宜值為 13.15 mmol/L，臨界值為 71.06 mmol/L，極限值為 128.97 mmol/L。

圖 3 NaCl 脅迫對(duì)龍膽種子發(fā)芽率的影響4.2 NaCl 脅迫對(duì)龍膽種子相對(duì)發(fā)芽率的影響為進(jìn)一步研究龍膽種子的耐鹽程度，將相對(duì)發(fā)芽率與相對(duì)應(yīng)的鹽濃度之間進(jìn)行相關(guān)回歸分析，如圖 4，結(jié)果表明，NaCl 脅迫下的相對(duì)發(fā)芽率隨鹽溶液濃度的升高而降低，相對(duì)發(fā)芽率與 NaCl 溶液濃度表現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為 0.8510，回歸方程為：y=-19.427x+100.10。以相對(duì)發(fā)芽率的 75%、50%、25%時(shí)所對(duì)應(yīng)的 NaCl 濃度作為龍膽種子發(fā)芽時(shí)鹽脅迫的適宜值、臨界值和極限值。得出 NaCl 脅迫時(shí)，龍膽種子在萌發(fā)期間鹽脅迫的適宜值為 13.15 mmol/L，臨界值為 71.06 mmol/L，極限值為 128.97 mmol/L。
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