本研究以靈芝和毛木耳作為硒的轉(zhuǎn)化生物體,系統(tǒng)研究硒對(duì)兩種食藥用菌子實(shí)體農(nóng)藝性狀、活性成分、轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)及基質(zhì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響,篩選靈芝、毛木耳基質(zhì)最適硒含量,為靈芝和毛木耳富硒深入研究以及開發(fā)食藥用菌功能性食品、保健品奠定理論基礎(chǔ)。研究不同硒處理對(duì)培養(yǎng)料理化性質(zhì)的影響表明:靈芝培養(yǎng)料pH以菌絲滿袋時(shí)總體最低,原基形成時(shí)總體最高,且靈芝不同生長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)料pH值大體隨硒含量的增加呈先增后減趨勢(shì);毛木耳培養(yǎng)料pH值在菌絲滿袋及耳片擴(kuò)長(zhǎng)時(shí)較高,原基形成時(shí)最低。靈芝培養(yǎng)料含水量大體隨生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),在子實(shí)體成熟時(shí)總體最低,所有富硒處理培養(yǎng)料含水量在子實(shí)體成熟時(shí)顯著低于在原基形成時(shí);而毛木耳培養(yǎng)料含水量隨生長(zhǎng)及硒含量變化不明顯。培養(yǎng)料全氮、全磷和全鉀含量作為研究背景指標(biāo),受生長(zhǎng)時(shí)期及硒含量的影響不明顯。綜上可見,靈芝、毛木耳生長(zhǎng)與硒含量共同影響培養(yǎng)料的理化性質(zhì),而生長(zhǎng)時(shí)期為主要影響因子。研究不同硒處理對(duì)靈芝/毛木耳生長(zhǎng)及生物活性物質(zhì)含量的影響表明:硒可促進(jìn)靈芝菌絲生長(zhǎng),以硒含量為100μg/g時(shí)對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度提高最顯著;但硒顯著降低毛木耳菌絲生長(zhǎng)速度。硒可增加靈芝菌柄長(zhǎng)度及菌蓋大小,而減小菌蓋厚度,對(duì)靈芝產(chǎn)量影響趨勢(shì)不明顯,以硒含量為200μg/g時(shí)產(chǎn)量最高;毛木耳耳片大小、平均簇重及鮮耳產(chǎn)量隨培養(yǎng)料硒含量的增加呈先增后減的趨勢(shì),平均簇重及鮮耳產(chǎn)量皆以硒含量為100μg/g時(shí)最大,且顯著大于對(duì)照,但硒顯著減小耳片厚度。硒可顯著促進(jìn)靈芝子實(shí)體三萜酸和毛木耳子實(shí)體粗多糖的生成,而對(duì)靈芝子實(shí)體多糖含量影響趨勢(shì)不明顯。同時(shí),靈芝和毛木耳可有效富集硒元素,其子實(shí)體總硒含量大體隨培養(yǎng)料硒含量的增加而提高。培養(yǎng)料細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析表明:靈芝培養(yǎng)料以變形桿菌門豐度最高,而毛木耳以厚壁菌門豐度最高。靈芝培養(yǎng)料變形桿菌門豐度隨靈芝的生長(zhǎng)先減后增,且大致隨培養(yǎng)料硒含量的增加而降低;厚壁菌門在毛木耳原基形成時(shí)豐度最大,而富硒對(duì)厚壁菌門豐度影響不明顯。其它優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門包括酸桿菌門、擬桿菌門和放線菌門等。另外,靈芝、毛木耳培養(yǎng)料優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬分別為L(zhǎng)actococcus和Brevibacillus。細(xì)菌功能預(yù)測(cè)共鑒定出靈芝、毛木耳培養(yǎng)料細(xì)菌KEGG通路39條、41條,主要涉及代謝、環(huán)境信息處理和遺傳信息處理。另外,靈芝、毛木耳生長(zhǎng)過程中,膜轉(zhuǎn)運(yùn)為最主要的生物途徑;該生物途徑在靈芝菌柄伸長(zhǎng)和子實(shí)體成熟時(shí)整體豐度減小,而隨毛木耳的生長(zhǎng)豐度也呈減小趨勢(shì);硒對(duì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)生物途徑影響明顯。轉(zhuǎn)錄組分析共獲得靈芝16113個(gè)確定的表達(dá)基因,GO數(shù)據(jù)庫(kù)以分子功能相關(guān)的基因最多;毛木耳拼接獲得2.56×10~5個(gè)基因,以生物進(jìn)程相關(guān)的基因最多。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn),靈芝原基形成與子實(shí)體成熟時(shí),以氨基酸生物合成相關(guān)途徑基因表達(dá)最活躍。而毛木耳轉(zhuǎn)錄組與“翻譯”相關(guān)基因占比最大,且毛木耳原基形成和子實(shí)體成熟時(shí),富硒對(duì)與“生物體系統(tǒng)”相關(guān)的所有基因有上調(diào)影響�；虿町惐容^發(fā)現(xiàn),靈芝及毛木耳原基形成時(shí)高表達(dá)基因在子實(shí)體成熟時(shí)呈現(xiàn)下調(diào);靈芝原基形成時(shí)低表達(dá)的基因在子實(shí)體成熟時(shí)表達(dá)活躍;毛木耳與硒相關(guān)的基因原基形成時(shí)比子實(shí)體成熟時(shí)表達(dá)更加活躍。研究挖掘潛在的硒富集相關(guān)基因,如靈芝富硒上調(diào)基因GL23172-G、GL29881-G、GL28298-G等,在氧化還原酶及抗氧化活性、色氨酸合成方面起到調(diào)控作用;毛木耳富硒下調(diào)基因c108476_g4與c102698_g1,參與到多種氨基酸的合成及細(xì)胞色素P450外源性代謝。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S567.31;S646.6
【部分圖文】：

其中，有 15.7% OTU 單元未鑒定到門水平，且靈芝生長(zhǎng)不同時(shí)期高質(zhì)列數(shù)量為 25996-69618 個(gè)（表 1-3）。結(jié)果顯示，靈芝四個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期培養(yǎng)料細(xì)菌 OTU 單元為 295 個(gè)（圖 1-2）。靈芝整個(gè)生長(zhǎng)過程培養(yǎng)料中共檢測(cè)到細(xì)菌門（表 1-4）。其中，最豐富的細(xì)菌門為變形桿菌門，占所有細(xì)菌序列.47%-72.86%（平均為 57.23%）；厚壁菌門次之，占比 22.50%-40.33%（平.12%），以上兩個(gè)細(xì)菌門共計(jì)占比 80.12%-95.93%。而平均豐度>1%的其它細(xì)菌門包括擬桿菌門（3.30%）、酸桿菌門（2.75%）和放線菌門（2.03%）表 1-3 靈芝四個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期高質(zhì)量序列數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table1-3 High quality read distribution between samples靈芝生長(zhǎng)時(shí)期 重復(fù) 1 重復(fù) 2 重復(fù) 3菌絲滿袋 54,662 49,181 49,930原基形成 69,618 66,014 65,561菌柄伸長(zhǎng) 43,333 35,896 34,095子實(shí)體成熟 46,829 25,996 49,583

圖 1-4 靈芝不同生長(zhǎng)時(shí)期培養(yǎng)料細(xì)菌 NMDS 分析Fig. 1-4 Nonmetric Multidimensional Scaling ordination of bacterial communitiesbased on weighted UniFrac distance point in the diagram represents a bacterial community sample. The closer distance betweentsin the ordination space indicatesthe lower dissimilarity between the microbial communityture of these two samples.LEfSe 分析用于揭示所有細(xì)菌分類水平上靈芝四個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期培養(yǎng)料豐度的細(xì)菌分類群（圖 1-5）。結(jié)果表明，靈芝原基形成時(shí)期根瘤菌目zobiales（如 Rhodoplanes 屬）和 Sphingobium 屬的豐度顯著高于其它三期。而富蘭克氏菌科、Alkaliphilus 屬和 Erwinia 屬在靈芝菌絲滿袋時(shí)期三個(gè)時(shí)期，在培養(yǎng)料中顯著富集。另外，大量細(xì)菌類群在靈芝菌柄伸長(zhǎng)出較高的豐度，如擬桿菌門（Flavobacterium 屬和 Sediminibacterium 屬菌門（Candidatus Koribacter 屬）、硝化螺旋菌門（Nitrospira 屬）、藍(lán)細(xì)鏈霉菌目）和其它細(xì)菌類群，如黃單胞桿菌目 Xanthomonadales 和紅螺

圖 1-5 靈芝不同生長(zhǎng)時(shí)期培養(yǎng)料細(xì)菌 LEfSe 分析Fig. 1-5A cladogram showing the differentially abundant bacterial taxaat each of the fourgrowing stages of G. lucidum based on LEfSe analysis(P < 0.05, LDA score > 2)3.1.3 培養(yǎng)料細(xì)菌代謝功能預(yù)測(cè)研究共鑒定出培養(yǎng)料細(xì)菌 39 條 KEGG 通路（圖 1-6）。這些通路中，48.93%與代謝有關(guān)，17.24%與環(huán)境信息處理有關(guān)，14.23%與遺傳信息處理有關(guān)。最普遍的十大生物途徑涉及四種功能類型，即新陳代謝、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理和未分類。通過 PICRUSt 方法預(yù)測(cè)的培養(yǎng)料細(xì)菌 KEGG 主要途徑為膜轉(zhuǎn)運(yùn)，靈芝生長(zhǎng)各時(shí)期平均占比 15.93%。而碳水化合物代謝（平均豐度 10.03%）和氨基酸代謝（平均豐度 9.81%）分別為豐度第二和第三高的生物途徑。表 1-8 統(tǒng)計(jì)了靈芝不同生長(zhǎng)階段培養(yǎng)料細(xì)菌相對(duì)豐度大于 1%的生物途徑。由表可見，靈芝菌柄伸長(zhǎng)時(shí)期有較多的細(xì)菌功能途徑和其它三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期不同。在靈芝菌柄伸長(zhǎng)階段，膜轉(zhuǎn)運(yùn)、外源生物降解代謝生物途徑相對(duì)豐度有所降低；而所預(yù)測(cè)的其它生物途徑，如折疊、分類和降解、復(fù)制和修復(fù)、翻譯、碳水化合物代謝、能量代
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