干旱脅迫是全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的重大挑戰(zhàn)。減少植株水分散失是提高玉米抗旱性的重要途徑之一,玉米葉萎蔫突變體是研究水分散失的重要材料。研究葉萎蔫突變體基因的生物學(xué)功能和作用機(jī)理,將提高我們對玉米水分吸收、運(yùn)輸和散失的調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識,在此基礎(chǔ)上可通過遺傳改良的手段有目的地改良影響水分散失的關(guān)鍵性狀,提高玉米抗旱性。本研究以來源于自交系Lian87自然突變獲得的葉片萎蔫的多性狀變異突變體multi-trait weakened(muw)為材料,開展了突變位點(diǎn)的定位及遺傳分析,探究導(dǎo)致突變表型產(chǎn)生的遺傳學(xué)機(jī)制。另外,玉米穗行數(shù)是決定玉米產(chǎn)量的最重要性狀之一;因此,克隆控制玉米穗行數(shù)變異的關(guān)鍵基因,發(fā)掘其優(yōu)良等位基因,解析基因的功能,不僅有助于闡明穗行數(shù)形成的遺傳基礎(chǔ),也為玉米穗行數(shù)的遺傳改良提供理論指導(dǎo)及優(yōu)良的基因資源。本研究采用圖位克隆策略精細(xì)定位并克隆了一個新的控制玉米穗行數(shù)主效QTL KRN8.03,并利用表達(dá)分析和候選基因關(guān)聯(lián)分析等手段初步證實(shí)了該基因的生物學(xué)功能及功能位點(diǎn)。獲得的主要研究結(jié)果如下:1、突變體表型分析。muw全株葉片萎蔫卷曲,從葉尖到葉邊緣逐漸干枯死亡,田間高溫干旱的情況下,萎蔫表型更明顯。與野生型植株相比,突變體植株的生長發(fā)育及產(chǎn)量均受到嚴(yán)重的影響。突變體葉片水分散失速率快于野生型。另外,通過水分運(yùn)輸相關(guān)的維管束數(shù)目、維管束中導(dǎo)管數(shù)目、水分散失相關(guān)的ABA含量、ABA敏感性、葉片蠟質(zhì)層和葉片氣孔數(shù)目等在突變體和野生型植株間的比較分析,發(fā)現(xiàn)突變體葉片氣孔密度顯著高于野生型葉片氣孔密度(P=1.86×10~(-7)),其它性狀均在野生型和突變體之間無顯著性差異。2、muw的遺傳定位。遺傳分析發(fā)現(xiàn)muw葉片萎蔫性狀受單隱性位點(diǎn)控制,通過BSA方法將muw定位在第2染色體標(biāo)記umc1485和umc1635之間;隨后利用圖位克隆策略進(jìn)一步將muw定位于標(biāo)記V78和V140間5.66Mb的區(qū)間內(nèi)。進(jìn)而根據(jù)區(qū)段內(nèi)交換率的比較分析和PCR擴(kuò)增結(jié)果,推測muw基因組在定位區(qū)間內(nèi)存在大片段缺失。3、大片段缺失的位置確定與驗證。利用分布在定位區(qū)間內(nèi)的82對引物對muw和野生型基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,根據(jù)能否擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物判斷目標(biāo)片段是否缺失,結(jié)合測序分析,最終確定muw基因組中缺失一個長達(dá)5,161,714 bp(chr2:70,474,267–75,635,980 AGP_v4)的片段,內(nèi)含48個候選基因�；蚪MPCR擴(kuò)增結(jié)果表明,在muw基因組中,缺失片段內(nèi)含有的48個候選基因均擴(kuò)增不出產(chǎn)物,但是在野生型和其它葉片表型正常的自交系中48個候選基因均能擴(kuò)增出產(chǎn)物;此外,還發(fā)現(xiàn)20個在野生型苗期葉片中有表達(dá)的基因在muw中檢測不到表達(dá);說明片段確實(shí)缺失。4、穗行數(shù)QTL連鎖分析與KRN8.03精細(xì)定位。利用V54×Lian87 F_(2:3)分離群體,在4個環(huán)境下共檢測到12個控制玉米穗行數(shù)的QTL,其中KRN2,KRN4-2和KRN8.03在4個環(huán)境下均檢測到,且至少有1個環(huán)境可解釋的表型變異大于10%。進(jìn)而利用高代回交群體為材料及子代測驗方法開展KRN8.03的精細(xì)定位,最終將其定位在標(biāo)記M9和M11之間約150kb的區(qū)間內(nèi),該區(qū)間內(nèi)只有一個候選基因,命名為KRN8.03。5、KRN8.03候選基因關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明,位于外顯子上的4個LD的SNP與穗行數(shù)顯著相關(guān),但只有SNP493造成氨基酸錯義突變。顯著關(guān)聯(lián)的4個SNP構(gòu)成的2種單倍型中,Hap1為增效單倍型。qRT-PCR結(jié)果表明KRN8.03在近等基因系KRN8.03~(Lian87)和KRN8.03~(V54)的幼穗中表達(dá)差異達(dá)顯著水平(P0.05)。6、載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化。構(gòu)建了KRN8.03的超表達(dá)載體和基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因編輯載體,已獲得超表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料的T1代種子和基因編輯材料的T0代種子。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S513
【部分圖文】：

圖 1 玉米基因組 bz 區(qū)域在三個玉米自交系間的比較�；�，大倒三角表示轉(zhuǎn)座子。藍(lán)色的小倒三角代表 MITE（miniature i element）。缺失片段表示為虛線。圖片引自 Dooner and He 2008。Fig. 1 Organization of the bz genomic region in three different haplotyphown as pentagons. Transposons are shown as large inverted triangles inch occur in introns and intergenic regions, are shown as small blue triangl is missing in B73. Figure came from Dooner and He 2008.陣列比較基因組雜交技術(shù)比較基因組雜交(array comparative genomic hybridization，aC測人類和植物全基因組結(jié)構(gòu)變異的技術(shù)。其原理是將不同熒待測基因組和參考基因組的 DNA 雜交到一個微陣列上，這數(shù)千個根據(jù)已知基因序列開發(fā)的探針。如果在某一位點(diǎn)上待列雜交信號強(qiáng)度顯著偏離1:1比率，說明此處存在CNV或PA

玉米兩個重要位點(diǎn)的定位與克隆盡鏈球菌的可有可無基因組。而炭疽桿菌僅需要 4 個菌株的基因組就an-genome (Tettelin et al 2005)。玉米中也開展了構(gòu)建 pan-genome 的實(shí) et al 2014, Lu et al 2015)，但是玉米基因組中大量的重復(fù)序列和結(jié)構(gòu)變nome 構(gòu)建過程中要面臨的一個最大的挑戰(zhàn)。上這些基因組 SVs 檢測方法都有自身的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，而且到目前為止可以檢測出某一物種所有的結(jié)構(gòu)變異，最近有研究開始考慮結(jié)合不同以用于 SVs 的檢測(Escaramis et al 2015)。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆博士研究生學(xué)位論文析描述和分析表型觀察系 Lian87 田間繁種的過程中，我們發(fā)現(xiàn)一株葉片萎自交后代也表現(xiàn)為與親本一樣的全株葉片萎蔫，說變體命名為 muw（ multi-trait weakened）。田間觀察 5 葉期以前，突變體和野生型葉片均不萎蔫，隨著出現(xiàn)明顯的萎蔫卷曲表型，首先葉尖干枯發(fā)黃，隨整個葉片褪綠，葉邊緣更嚴(yán)重，田間高溫干旱情況

本文編號：2848100