細(xì)胞核雄性不育是我國油菜雜種優(yōu)勢利用的重要途徑之一。甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育材料7365系統(tǒng)的育性被認(rèn)為受兩對基因控制,即BnaMs3/Bnams3和Bnams4~a/Bnams4~b/Bnams4~c。前人推測Bnams4~a可能是通過DNA甲基化相關(guān)過程恢復(fù)Bnams4~b導(dǎo)致雄性不育。本研究在前人基礎(chǔ)上,通過對僅在Bnams4~a位點(diǎn)分離的736512AB近等基因系進(jìn)行了全基因組重亞硫酸鹽測序比較分析;通過轉(zhuǎn)化反向重復(fù)表達(dá)載體等實(shí)驗(yàn),對前人提出的sRNA通過RNA介導(dǎo)的DNA甲基化(RNA directed DNA methylation,RdDM)調(diào)控育性的觀點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證;通過BAC的單分子實(shí)時測序(single molecule real time,SMRT)對與Bnams4~a緊密連鎖的基因進(jìn)行驗(yàn)證與排除;在甘藍(lán)型油菜7365A中進(jìn)行Bnams4~a全長序列的遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證,并對啟動子中的串聯(lián)重復(fù)序列進(jìn)行截短分析。本研究的取得的主要結(jié)果如下:1.構(gòu)建了736512AB近等基因系的全基因組重亞硫酸鹽測序文庫,完成了甘藍(lán)型油菜花蕾全基因組DNA甲基化圖譜�？捎筒挥膸斓恼w甲基化水平分別為12.23%和13.00%,沒有顯著差異。兩個文庫中不同序列背景下的DNA甲基化水平都是CGCHGCHH。DNA甲基化在各條染色體上并非均勻分布,整體甲基化水平和CG、CHG、CHH序列環(huán)境的甲基化水平上,A_n亞基因組顯著低于C_n亞基因組�；ɡ僦蠨NA甲基化平均水平低于根與葉片。2.基因區(qū)與重復(fù)序列區(qū)域甲基趨勢不同:在啟動子區(qū)甲基化水平最高,隨著遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),甲基化水平迅速升高,直至穩(wěn)定水平;gene body區(qū)甲基化水平明顯要低,而其中內(nèi)含子區(qū)相對外顯子和UTR區(qū)較高。而重復(fù)序列區(qū)本身呈現(xiàn)出中間低而兩側(cè)高的趨勢,上下游1kb甲基化水平相對較低。3.可育與不育材料間存在局部甲基化差異:779個差異甲基化區(qū)間(differentially methylated region,DMR)中,低甲基化的DMR明顯較高甲基化的DMR多。在402個差異甲基化基因中鑒定到11個潛在的與花粉發(fā)育相關(guān)的基因,其中10個基因表達(dá)量有差異。隨機(jī)挑選8個基因進(jìn)行常規(guī)重亞硫酸鹽測序驗(yàn)證,結(jié)果與全基因組甲基化測序一致。此外,Bnams4的gene body區(qū)DNA甲基化差異明顯,表達(dá)量差異顯著。4.通過構(gòu)建調(diào)控區(qū)反向重復(fù)載體轉(zhuǎn)入Bnams4~b背景擬南芥中,顯著提高了Bnams4~b靶區(qū)間的DNA甲基化水平,而表達(dá)量沒有改變,育性也沒有恢復(fù);在擬南芥中超表達(dá)Bnams4~a的gDNA得到的是雄性不育表型,Bnams4~a全長轉(zhuǎn)化野生型擬南芥也是雄性不育表型。排除了Bnams4~a通過調(diào)控區(qū)sRNA經(jīng)RdDM路徑恢復(fù)育性的推測。5.通過單分子實(shí)時測序(SMRT),完成了Bnams4~a和Bnams4~b BAC的完整拼接,序列比較顯示,在Bnams4~a上游5kb左右的位置,新發(fā)現(xiàn)兩個插入片段。806上預(yù)測編碼一個未知功能蛋白,1667上預(yù)測編碼一個甲基轉(zhuǎn)移酶。將含兩個片段的序列分別構(gòu)建互補(bǔ)載體對Bnams4~b背景擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,均不能恢復(fù)Bnams4~b的育性,基本排除Bnams4~a為Bnams4~b緊密連鎖基因的可能。6.Bnams4~a全長對甘藍(lán)型油菜7365A全不育材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,得到138株陽性苗,其中81株育性得到恢復(fù)。育性恢復(fù)株gene body區(qū)DNA甲基化水平顯著降低,Bnams4表達(dá)量顯著降低。7.Bnams4啟動子由3段串聯(lián)重復(fù)(tandem repeat,TR)序列TR1、TR2和TR3正向串聯(lián)組成,通過構(gòu)建不同數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列驅(qū)動Bnams4 CDS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。結(jié)果發(fā)現(xiàn):僅有5’UTR驅(qū)動Bnams4表達(dá)時,所有轉(zhuǎn)基因擬南芥均表現(xiàn)雄性可育;一個或多個串聯(lián)重復(fù)驅(qū)動Bnams4表達(dá)時,部分或所有陽性苗均表現(xiàn)為雄性不育。這些結(jié)果說明Bnams4啟動子中串聯(lián)重復(fù)序列是其表達(dá)所必需的。本研究對油菜花蕾盡行了全基因組甲基化分析,排除了Bnams4~a啟動子區(qū)差異導(dǎo)致的育性變化,排除了與Bnams4~a緊密連鎖的育性恢復(fù)基因,通過在油菜7365A中成功的對Bnams4~a進(jìn)行了互補(bǔ)驗(yàn)證。本研究完善了油菜全基因組甲基化圖譜、對7365A育性恢復(fù)及嵌合新基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制的解析奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S565.4
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
1 前言
    1.1 植物中DNA甲基化
    1.2 DNA甲基化狀態(tài)的建立、維持與去除
    1.3 DNA甲基化的功能
        1.3.1 啟動子DNA甲基化與基因表達(dá)調(diào)控
        1.3.2 Gene body區(qū) DNA甲基化的功能
    1.4 DNA甲基化分析方法
    1.5 DNA甲基化在植物雄性不育中的研究
    1.6 甘藍(lán)型油菜全基因組DNA甲基化研究
    1.7 油菜雄性不育與雜種優(yōu)勢利用
    1.8 S45A雄性不育分子機(jī)理研究進(jìn)展
        1.8.1 Bnms1和Bnms2 的定位與克隆
        1.8.2 S45A育性控制機(jī)理
    1.9 9012A/7365A雄性不育分子機(jī)理研究進(jìn)展
        1.9.1 BnaMs3 的圖位克隆與及其新功能化
        1.9.2 9012A/7365A遺傳模式修正
        1.9.3 Bnams4~b的圖位克隆
        1.9.4 7365A育性控制的分子機(jī)理研究
    1.10 顯性核不育宜3A雄性不育分子機(jī)理研究進(jìn)展
        1.10.1 BnaMs5的定位與克隆
        1.10.2 顯性核不育的育性控制機(jī)理
    1.11 細(xì)胞核不育利用途徑
    1.12 本研究的目的和意義
2 材料和方法
    2.1 油菜材料
    2.2 擬南芥材料
    2.3 菌株與載體
    2.4 全基因DNA甲基化測序與分析
        2.4.1 文庫構(gòu)建與全基因組重亞硫酸鹽測序
        2.4.2 測序質(zhì)量控制
        2.4.3 比對到參考基因組
        2.4.4 差異甲基化區(qū)域(DMR)分析
    2.5 常規(guī)重亞硫酸鹽PCR測序驗(yàn)證
    2.6 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR
    2.7 載體構(gòu)建
        2.7.1 反向重復(fù)載體構(gòu)建
        2.7.2 gDNA超表達(dá)的構(gòu)建
        2.7.3 CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建
        2.7.4 互補(bǔ)載體構(gòu)建
        2.7.5 啟動子截短載體構(gòu)建
    2.8 簡單粗暴法提取DNA
    2.9 BAC的單分子實(shí)時測序與拼接
    2.10 花藥醋酸洋紅染色
    2.11 花藥亞歷山大染色
    2.12 甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化
    2.13 擬南芥根外植體遺傳轉(zhuǎn)化
    2.14 擬南芥蘸花法遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因陽性苗篩選
3 結(jié)果與分析
    3.1 近等基因系表型觀察
    3.2 油菜花蕾全基因組甲基化分析
        3.2.1 油菜花蕾全基因組甲基化圖譜
        3.2.2 差異甲基化位點(diǎn)分析
        3.2.3 差異甲基化基因驗(yàn)證
        3.2.4 育性相關(guān)基因定量PCR驗(yàn)證
    3.3 Bnams4甲基化與表達(dá)分析
    3.4 sRNA區(qū)轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證
        3.4.1 sRNA超表達(dá)表型分析
        3.4.2 sRNA超表達(dá)DNA甲基化與基因表達(dá)分析
        3.4.3 CRISPR/Cas9編輯sRNA區(qū)結(jié)果
        3.4.4 gDNA超表達(dá)轉(zhuǎn)基因結(jié)果
    3.5 Bnams4~a轉(zhuǎn)化擬南芥結(jié)果
    3.6 BAC的重新測序與驗(yàn)證
        3.6.1 BAC單分子實(shí)時測序與分析驗(yàn)證
        3.6.2 新發(fā)現(xiàn)的2個基因的轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證
    3.7 Bnams4~a油菜轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證
        3.7.1 Bnams4~a全長轉(zhuǎn)化不育背景油菜
        3.7.2 育性恢復(fù)株中Bnams4 甲基化與表達(dá)分析
    3.8 Bnams4 啟動子tandem repeat初步分析
4 討論
    4.1 油菜花蕾全基因組甲基化圖譜
    4.2 WGBS在鑒定育性相關(guān)基因中的應(yīng)用
    4.3 Bnams4調(diào)控區(qū)的sRNA可能不是育性恢復(fù)的原因
    4.4 Bnams4~a是Bnams4~b的復(fù)等位基因
    4.5 Bnams4~a恢復(fù)育性的可能機(jī)制
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ
    附錄1 油菜下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方
    附錄2 擬南芥根外植體遺傳轉(zhuǎn)化配方
    附錄3 使用SeqMan批量去除載體序列流程
    附錄4 本研究所用BS PCR和q-RT PCR引物
    附錄5 本研究用到的其他引物
        附圖1 19條染色體在三種序列環(huán)境下的DNA甲基化分布
        附圖2 ChrC1上24MB位置處的一個局部DNA甲基化差異
        附圖3-1 3個基因的常規(guī)重亞硫酸鹽PCR驗(yàn)證
        附圖3-2 2個基因的常規(guī)重亞硫酸鹽PCR驗(yàn)證
        附圖4 806 ORF與 BnaA06g31090D氨基酸序列比較
        附圖5 1667 ORF與擬南芥同源基因氨基酸序列比較
        附圖6 油菜CRISPR/Cas9植株T2 代混合測序結(jié)果
附錄Ⅱ:作者簡歷及研究生階段發(fā)表論文成果
    作者簡歷
    文章發(fā)表
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2847060