葉霉病、枯萎病、果腐病等各類(lèi)植物病害及其日益嚴(yán)重的抗藥性嚴(yán)重影響寄主植物的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn),這種現(xiàn)狀對(duì)新藥的研發(fā)提出了更高的要求,迫使人們尋找抗動(dòng)、植物病害及環(huán)境友好的新的天然生物活性物質(zhì)。由于藥用植物含有數(shù)量眾多的具有抗菌、抗炎、促生等功能的有效化學(xué)成分,其內(nèi)生放線(xiàn)菌存在于寄主植物各組織和器官內(nèi),長(zhǎng)期以來(lái)與寄主形成了復(fù)雜且特殊的共生關(guān)系,并參與到植物生長(zhǎng)的各個(gè)階段,具備了產(chǎn)生與宿主植物相同或相似次生代謝產(chǎn)物的能力,因而在人類(lèi)及動(dòng)植物病害的生物防治方面起著重要的作用。伊犁塔城地區(qū)由于氣候溫和,雨量充沛,是新疆野生藥材的最主要的分布區(qū)域。百里香作為多用途植物,不僅是保持干旱區(qū)水土的重要植被,而且植株全株及其精油在醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)百里香的研究,主要集中在百里香及其芳香油的化學(xué)成分、藥理藥效、臨床應(yīng)用及植物、食品保鮮等方面,關(guān)于其內(nèi)生菌未見(jiàn)報(bào)道。本文以采自新疆伊犁、塔城的玫瑰百里香(Thymus roseus Schipcz.)作為材料,以其內(nèi)生放線(xiàn)菌為研究對(duì)象,經(jīng)過(guò)植物表面消毒處理后,應(yīng)用三種植物預(yù)處理方法和10種分離培養(yǎng)基分離內(nèi)生放線(xiàn)菌菌株。根據(jù)菌株的16S rRNA基因序列信息及其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)探討藥用植物內(nèi)生放線(xiàn)菌的物種多樣性,比較不同地理環(huán)境下的百里香內(nèi)生放線(xiàn)菌組成及功能上的多樣性,同時(shí)比較玫瑰百里香不同組織中內(nèi)生放線(xiàn)菌的分布。另外對(duì)內(nèi)生放線(xiàn)菌的抗病、產(chǎn)鐵載體和幾丁質(zhì)酶能力以及抗生素生物合成酶基因的有無(wú)進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果顯示,從玫瑰百里香分離到181株內(nèi)生放線(xiàn)菌,通過(guò)比較三種植物預(yù)處理方法對(duì)內(nèi)生放線(xiàn)菌出菌率的影響發(fā)現(xiàn),-80℃冷凍處理的玫瑰百里香分離內(nèi)生放線(xiàn)菌的效果最佳。結(jié)合-80℃冷凍處理法與腐殖酸維生素(HV)培養(yǎng)基分離內(nèi)生放線(xiàn)菌,更能有效提高內(nèi)生放線(xiàn)菌的出菌率。根據(jù)培養(yǎng)和形態(tài)特征在不同預(yù)處理間去重后得到的126株菌株(55株來(lái)自伊犁地區(qū)的百里香,71株來(lái)自塔城地區(qū)的百里香)構(gòu)建基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果表明上述菌株分屬于放線(xiàn)菌門(mén)的2個(gè)綱、8個(gè)目、14個(gè)科、24個(gè)屬,玫瑰百里香T.roseus Schipcz內(nèi)生放線(xiàn)菌多樣性豐富。多樣性參數(shù)值表明,生長(zhǎng)在塔城地區(qū)的百里香內(nèi)生放線(xiàn)菌物種組成比伊犁地區(qū)的豐富,然而主要優(yōu)勢(shì)屬相同,均為鏈霉菌屬。內(nèi)生放線(xiàn)菌在玫瑰百里香不同組織部位的分布中,其在根部更為豐富,而且大多屬于鏈霉菌屬;大多數(shù)內(nèi)生放線(xiàn)菌的分布具有普遍性外,部分菌株具有組織專(zhuān)一性。從玫瑰百里香分離到的126株內(nèi)生放線(xiàn)菌對(duì)指示菌的抗菌活性結(jié)果顯示,有54株菌株對(duì)一個(gè)或多個(gè)指示菌表現(xiàn)出了抑制能力。其中,菌株T4SB028(Streptomyces polyantibioticus)對(duì)Alternaria solani、Valsa malicola和Valsa mali的相對(duì)抑菌率分別高達(dá)67.06%、64.20%和70.55%。結(jié)果表明,玫瑰百里香內(nèi)生放線(xiàn)菌具有抑菌廣譜性,是蘋(píng)果腐爛病菌、番茄早疫病菌以及腸炎沙門(mén)氏菌等病原菌的拮抗菌種庫(kù),而且大多數(shù)拮抗性菌株屬于鏈霉菌屬。在本次研究中,30.95%和23.01%的內(nèi)生放線(xiàn)菌分別能產(chǎn)生鐵載體和幾丁質(zhì)酶,與此同時(shí),42.86%內(nèi)生放線(xiàn)菌至少對(duì)一至九種供試病原菌表現(xiàn)出了不同程度的抑菌作用,可以看出,有些內(nèi)生放線(xiàn)菌具有產(chǎn)生鐵載體和幾丁質(zhì)酶能力的同時(shí)對(duì)供試病原菌具有抑制作用,有望研發(fā)成生物防治所需的微生物菌劑。另外,抗生素生物合成酶基因(PKS和NRPS)在百里香拮抗性?xún)?nèi)生放線(xiàn)菌中均有分布,其中PKS II的檢出率相比其它兩個(gè)基因的高,而且大多屬于鏈霉菌屬。百里香內(nèi)生放線(xiàn)菌在野生藥用植物百里香的保護(hù)中具有重要意義,并且為病害植株的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)提供了潛在的生防菌株,同時(shí)為人類(lèi)及動(dòng)物病害治療有關(guān)的天然活性物質(zhì)及新藥的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S567;Q93
【部分圖文】：

圖 1.1 植物內(nèi)生放線(xiàn)菌分離的基本流程Fig.1.1 The basic isolation flow of plant endophytic actinomycetes生菌分離的關(guān)鍵之一是表面消毒。在對(duì)樣品進(jìn)行表面消毒以前首先行清洗，包括用流水沖洗和超聲波清洗等以便去除植物樣品表面免土壤微生物的干擾。對(duì)樣品進(jìn)行表面消毒時(shí)可以選用一些表面、Tween20、Tween80 等來(lái)降低表面張力，使消毒劑與植物表面得35]。對(duì)樣品進(jìn)行消毒時(shí)通常用乙醇，次氯酸鈉或過(guò)氧化氫等消毒劑般樣品的不同，導(dǎo)致消毒所需消毒劑的種類(lèi)、濃度及消毒時(shí)間的用濃度為 70 % - 90 %的乙醇以及 1 % - 10 % 的次氯酸鈉進(jìn)行消毒以及植物組織不同，相應(yīng)的消毒時(shí)間也就不同。一般木本植物所需于草本植物，根比莖與葉需要的消毒時(shí)間長(zhǎng)。何判斷分離到的微生物是內(nèi)生菌，這就需要借助間接的檢測(cè)方法—的有效性檢測(cè)。主要包括三種方法：(1) 將表面消毒后的樣品直接

圖 1.2 新疆區(qū)域劃分圖Fig.1.2 Divided region of Xinjiang功能基因簡(jiǎn)介 PKS I 和 PKS II和非核糖體肽類(lèi)均是天然產(chǎn)物中的兩大家族。聚酮類(lèi)化合物的(Polyketide synthase，PKS)催化而完成的。聚酮合酶分為三塊型(PKS-I)、II 型又稱(chēng)芳香型(PKS-II)及 PKS-Ⅲ型又稱(chēng)查爾-I 主要由酮基合成酶(ketosynthase, KS)、烯酞還原酶(enoylred酶(aeyltransferase, AT)、酮基還原酶(ketoreducatase, KRase, DH)和酞基載體蛋白(aeylcamerprotein, ACP)等功能域組成“最小 PKS”是 KS、AT 和 ACP。在此延伸反應(yīng)中，從 AT 選般為乙酸或丙酸)連接到鏈上，縮合反應(yīng)由 KS 催化，接著 A

生放線(xiàn)菌種類(lèi)和數(shù)量都有所不同。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)百里香內(nèi)生放線(xiàn)菌的分離方法進(jìn)行了探索，比較不同培養(yǎng)基之間所分離內(nèi)生放線(xiàn)菌的差異，從而找出內(nèi)生放線(xiàn)菌分離的最適培養(yǎng)基，以此為百里香內(nèi)生放線(xiàn)菌的分離提供一定的實(shí)驗(yàn)方法。本實(shí)驗(yàn)用 10 種分離培養(yǎng)基從伊犁、塔城兩個(gè)地區(qū)的玫瑰百里香中共分離獲得內(nèi)生放線(xiàn)菌 181 株。圖 2.1 顯示了百里香在不同 10 種培養(yǎng)基中內(nèi)生放線(xiàn)菌的分離情況，從中可以看出，M 7 號(hào)培養(yǎng)基分離到的內(nèi)生放線(xiàn)菌數(shù)量最多，為 30株，其次為 M 5 (28 株)、M 6(26 株)、M 8(24)，然而從 M 3、M 4 號(hào)培養(yǎng)基中分離到的內(nèi)生放線(xiàn)菌為數(shù)最少，分別為 6 和 7 株，這表明從不同的培養(yǎng)基分離出的放線(xiàn)菌數(shù)目具有較大差異。此外，圖 2.1 比較了百里香不同部位內(nèi)生放線(xiàn)菌的分離效果，可以看出，M 8 培養(yǎng)基從葉片分離到的內(nèi)生放線(xiàn)菌數(shù)量相比其他培養(yǎng)基的多，因此可以認(rèn)為百里香葉片內(nèi)生放線(xiàn)菌的分離最適培養(yǎng)基為 M 8 培養(yǎng)基，然而分離百里香根、莖內(nèi)生放線(xiàn)菌的最適培養(yǎng)基分別為 M 5，M 7 號(hào)培養(yǎng)基。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2832966