三椏苦Melicope pteleifolia(Champion ex Bentham)T.G.Hartlry 為蕓香科的一種常綠小喬木植物,主要分布在華南地區(qū),常用于城市和園林綠化。三椏苦的干燥莖及帶葉嫩枝是嶺南地區(qū)的一種常用中藥(中藥名:三叉苦)。三叉苦味苦、性寒,歸心、肝經(jīng),具有清熱解毒、祛風除濕和消腫止痛等多種功效,臨床上主要用于治療感冒發(fā)熱、扁桃體炎、咽喉炎、黃疸型肝炎、胃脘疼痛、瘧疾、風濕痹痛、跌打腫痛、濕疹、皮炎和痔瘡等癥。此外,三叉苦也是廣東涼茶、三九感冒靈和三九胃泰等中成藥的重要原料。三椏苦的分布地區(qū)較廣泛,但是大多呈零星分布,而市場需求巨大,其野生資源日益匱乏。目前,已有不少企業(yè)開始對三椏苦進行規(guī)�；N植,以填補市場需求的缺口。由于三椏苦種子量大易得,大部分企業(yè)主要采用種子繁殖方式進行育苗。但在實際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn),三椏苦種子的發(fā)芽率極低。為提高種子繁殖效率,降低育苗成本,本課題組針對三椏苦種子發(fā)芽率極低的情況展開了系統(tǒng)研究�；谇捌陬A(yù)實驗,本課題組提出假說,“三椏苦種子可能存在休眠現(xiàn)象”。本研究首先通過生物學特性研究全面掌握三椏苦種子的生物學特性,推測三椏苦種子具有休眠特性,為三椏苦種子的休眠解除方法研究提供一個方向;其次,通過嘗試多種處理方法,篩選得到簡單實用的破眠方法,并為三椏苦種子休眠解除機理研究提供理想的測序材料;再次,在大棚內(nèi)進行發(fā)芽試驗,考察在實驗室中摸索出的種子處理方法對實際生產(chǎn)的適用性;然后,通過嘗試在多種條件下進行發(fā)芽試驗,篩選出三椏苦種子的適宜采收期和萌發(fā)條件;最后,建立了三椏苦種子的全長轉(zhuǎn)錄組作為參考序列,并對休眠解除前后的種子進行比較組學研究,以闡明三椏苦種子的休眠解除機理。主要研究結(jié)果如下:1.三椏苦種子的生物學特性在接近成熟期間,三椏苦果實經(jīng)歷了果皮開裂和干枯的過程。在生長過程中,三椏苦種子從白色變?yōu)辄S色,再變?yōu)榧t色,最后變?yōu)楹谏３墒斓娜龡靠喾N子的質(zhì)量較小,千粒重為7.53±0.07 g;其所含水分較少,含水量為11.81 ± 0.14%,便于種子貯藏;其體積較小,長為 2.89±0.10 mm,寬為 2.23±0.14 mm,厚為 1.84±0.10 mm。成熟的三椏苦種子呈橢球形,由種皮、胚乳和雙子葉的胚組成,種皮表面覆蓋了一層黑色油亮的蠟質(zhì)。按照胚乳的有無進行植物學分類,三椏苦種子屬于雙子葉植物有胚乳種子類別。本研究還觀察并記錄了三椏苦種子的整個發(fā)芽過程。最后,將三椏苦與同科具有休眠的其他物種的種子的生物學特性進行了比較,推測種皮可能是三椏苦種子休眠的一種重要因素。2.三椏苦種子具有復(fù)合休眠考察了多種種皮處理方法對三椏苦種子發(fā)芽率的影響。三椏苦種子經(jīng)過濃硫酸處理(在濃硫酸中浸泡2、4或6分鐘)、氫氧化鈉溶液處理(在30%氫氧化鈉溶液中浸泡10、20或30分鐘)或搓洗處理后,發(fā)芽率均顯著提高,說明三椏苦種子具有種皮引起的物理休眠。在所有種皮處理組中,搓洗處理組的發(fā)芽率最高(42.67±4.62%),與其它處理組的發(fā)芽率相比,均具有統(tǒng)計學差異。因此,搓洗處理被優(yōu)選為最佳的種皮前處理方法。經(jīng)過種皮前處理后發(fā)芽率顯著提高,但仍低于50%,且發(fā)芽周期較長(2個月)。因此,本課題組推測三椏苦種子可能還存在生理休眠。采用三種常用的生理休眠解除方法(低溫層積、暖溫層積和赤霉素溶液浸種處理)進行試驗。結(jié)果表明,經(jīng)過種皮前處理的三椏苦種子低溫(4℃)層積15天和30天,發(fā)芽率沒有進一步顯著提高。經(jīng)過種皮前處理的三椏苦種子暖溫(30℃)層積5天,發(fā)芽率沒有進一步顯著提高;而暖溫(30℃)層積10和15天,發(fā)芽率進一步顯著提高,且暖溫層積15天的效果最好(發(fā)芽率為82.00±3.46%)。經(jīng)過種皮前處理的三椏苦種子在100、200、300和400 mg·L-1的赤霉素溶液中浸泡24小時后,發(fā)芽率都進一步顯著提高,且300 mg·L-1的赤霉素溶液處理效果最好(發(fā)芽率為77.33±5.03%)。這說明三椏苦種子同時具有種胚引起的生理休眠。因此,三椏苦種子具有復(fù)合休眠,搓洗處理加暖溫層積15天(或在300 mg·L-1的赤霉素溶液中浸泡24小時)可以解除三椏苦種子的復(fù)合休眠。為了考察實驗室中篩選出的種子處理方法對三椏苦實際生產(chǎn)的適用性,還進行了大棚發(fā)芽試驗。在大棚條件下,種皮處理組的發(fā)芽率顯著高于種皮未處理組;種皮處理聯(lián)合100 mg·L-1或300 mg·L-1的赤霉素處理組的發(fā)芽率都顯著高于單純種皮處理組。種皮處理聯(lián)合暖溫層積5天組的發(fā)芽率與單純種皮處理組的發(fā)芽率無統(tǒng)計學差異;種皮處理聯(lián)合暖溫層積15天組的發(fā)芽率顯著高于單純種皮處理組的發(fā)芽率。大棚發(fā)芽試驗結(jié)果的總體趨勢與實驗室結(jié)果基本一致,表明了在實驗室中摸索出的三椏苦種子處理方法對于實際生產(chǎn)具有良好的適用性。3.三椏苦種子的適宜采收期和萌發(fā)條件考察了不同采收期、不同發(fā)芽床、光照有無和不同溫度對三椏苦種子發(fā)芽率的影響。果皮在樹上大規(guī)模自然開裂時采集的三椏苦種子的發(fā)芽率更高;不同發(fā)芽床上培養(yǎng)的三椏苦種子,以及不同光照條件下培養(yǎng)的三椏苦種子的發(fā)芽率無統(tǒng)計學差異,說明發(fā)芽床和光照對三椏苦種子發(fā)芽率無影響。在30℃(12 h)/20℃(12 h)變溫條件下培養(yǎng)的三椏苦種子的發(fā)芽率顯著高于20℃、25℃和30℃恒溫下培養(yǎng)的三椏苦種子的發(fā)芽率,說明不同溫度對三椏苦種子發(fā)芽率具有顯著影響,且30℃(12 h)/20℃(12 h)的變溫條件更有利于三椏苦種子的萌發(fā)。4.暖溫層積解除三椏苦種子休眠的機理由于三椏苦沒有參考基因組,在研究三椏苦種子的休眠解除機理之前,需要建立一個可用的參考序列。本研究采用三代和二代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),獲得了 98892個isoforms和93481個unigenes作為參考序列。通過比較轉(zhuǎn)錄組學研究,共鑒定到89216個倍數(shù)變化大于2的差異表達基因。其中,54686個差異表達基因顯著上調(diào),34530個差異表達基因顯著下調(diào)。根據(jù)這些差異表達基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)15天暖溫(30℃)層積引起的三椏苦種子的生理休眠解除主要與植物激素信號傳導(dǎo)通路中脫落酸受體、蛋白磷酸酶2C、赤霉素受體和DELLA蛋白等差異基因的顯著變化,代謝通路中腺苷激酶、甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、腺苷甲硫氨酸合成酶和二磷酸核苷激酶等差異表達基因的顯著變化,翻譯活動中翻譯起始因子和熱休克蛋白等差異表達基因的顯著變化和氨基酸的生物合成中β-天冬氨酰-半醛脫氫酶、異丙基蘋果酸合酶、酮醇酸還原異構(gòu)酶和磷酸甘油酸脫氫酶等差異表達基因的顯著變化相關(guān)。
【學位單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S567.19
【部分圖文】：

收是三相的，首先是一個初始的快速吸收（Ｉ相，也就是吸脹），然后是一個高原階段逡逑（ＩＩ相），水分吸收的進一步增加（ＩＩＩ相），發(fā)生在胚軸伸長并突破覆蓋層以完成萌發(fā)逡逑的時候（圖１－１）。在典型的被子植物種子中，包圍胚的有兩個覆蓋層：胚乳和外種皮逡逑（圖１－２）。細胞伸長是必需且公認為足以完成胚根的突出（可見的發(fā)芽）［９］。隨后的逡逑活動，包括主要貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，與幼苗的生長有關(guān)。實際上，所有己知的在非休眠逡逑種子萌發(fā)完成前發(fā)生的細胞和代謝活動，也發(fā)生在吸脹的休眠種子中；休眠種子的代逡逑謝活動，與非休眠種子稍微不同。因此，一個休眠的種子，可能完成幾乎所有的完全逡逑萌發(fā)需要的代謝步驟，然而，因為一些未知的原因，胚軸無法伸長（胚根無法突出）。逡逑萌發(fā)邐｜邐萌發(fā)后逡逑第１階段邐第２階段邐第３階段／逡逑貯藏物質(zhì)＾調(diào)動邐逡逑胚根細胞伸長／逡逑呼邐細＾裂和ＤＮＡ合成逡逑吸吸邐￣邐邐逡逑和邐ＤＮＡ修復(fù)逡逑．￣ｓ逡逑水白邐邐用新伊ｍｎ＾Ａｓ合成蛋白質(zhì)逡逑質(zhì)邋￣２＾逡逑合用

本文編號：2832715