小麥(Triticum aestivum)是我國重要的糧食作物之一,其高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)對國家糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展極其重要。低溫脅迫是一種主要的非生物脅迫,會嚴(yán)重影響小麥的生長與發(fā)育,從而降低其產(chǎn)量。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)自主培育出了能克服黑龍江地區(qū)高寒氣候條件的強(qiáng)耐寒冬小麥品種“東農(nóng)冬麥1號”(Dn1)(返青率≥85%),探討其抗寒機(jī)制至關(guān)重要。磷酸戊糖途徑(PPP)是真核生物NADPH的主要來源,并為生物合成提供代謝中間體。當(dāng)植物遭受非生物脅迫時,PPP途徑可以維持細(xì)胞的氧化還原平衡,因此,該途徑是植物抵抗非生物脅迫的關(guān)鍵途徑。6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH,EC.1.1.1.49)和6-磷酸葡糖酸脫氫酶(6PGDH,EC.1.1.1.44)是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶。本研究以大田自然降溫條件下種植的Dn1為基礎(chǔ)材料,測定4個溫度節(jié)點(5℃、0℃、-10℃、-25℃)下分蘗節(jié)和葉片中TaG6PDH與Ta6PGDH的活性及基因表達(dá)量,并從Dn1中分離TaG6PDH和Ta6PGDH基因,在擬南芥中過表達(dá),以探討其響應(yīng)低溫脅迫的生理與分子機(jī)制。實驗結(jié)果如下:(1)生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,冬小麥TaG6PDH和Ta6PGDH蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中,與烏拉爾圖小麥和山羊草親緣關(guān)系較近,并均含有底物結(jié)合位點和NADP~+結(jié)合位點。(2)隨著溫度降低,冬小麥分蘗節(jié)和葉片的TaG6PDH和Ta6PGDH的表達(dá)量逐漸升高,且分蘗節(jié)中兩種基因表達(dá)量的變化倍數(shù)高于葉片;外源ABA顯著提高低溫脅迫下TaG6PDH和Ta6PGDH的表達(dá)量。(3)冬小麥分蘗節(jié)中,TaG6PDH和Ta6PGDH的活性隨著溫度降低而升高,在-10℃達(dá)到峰值,但-25℃時又降低到5℃對照水平。葉片中,兩個酶的活性隨著溫度的降低并無顯著增加,但溫度降到-25℃時,活性急劇下降。外源ABA顯著提高低溫脅迫下TaG6PDH和Ta6PGDH的活性。(4)成功構(gòu)建了TaG6PDH和Ta6PGDH的超表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化擬南芥獲得超表達(dá)植株。(5)對野生型、突變體和超表達(dá)擬南芥植株進(jìn)行室內(nèi)低溫脅迫(4℃、0℃、-10℃)處理,TaG6PDH和Ta6PGDH的超表達(dá)植株都能夠在低溫脅迫后恢復(fù)到正常的生長狀態(tài)。生理指標(biāo)測定結(jié)果顯示,在相同的低溫下超表達(dá)植株與野生型和突變體相比有較高的葉綠素含量、較低的MDA含量及傷害率。DAB和NBT染色結(jié)果也顯示出超表達(dá)植株能夠在低溫脅迫下產(chǎn)生更少的活性氧(ROS),從而減少氧化脅迫對植株的傷害。(6)低溫脅迫下,擬南芥超表達(dá)植株中TaG6PDH、Ta6PGDH表達(dá)量在0℃和-10℃顯著升高,且TaG6PDH超表達(dá)植株中內(nèi)源At6PGDH基因表達(dá)量顯著高于野生型;同樣,Ta6PGDH超表達(dá)植株中內(nèi)源AtG6PDH基因的表達(dá)量也顯著高于野生型。(7)0℃和-10℃下,TaG6PDH超表達(dá)植株中G6PDH活性顯著高于野生型和突變體;同樣,Ta6PGDH超表達(dá)植株中6PGDH活性也顯著高于野生型和突變體。本研究初步證實了冬小麥胞質(zhì)TaG6PDH和Ta6PGDH響應(yīng)低溫脅迫,在擬南芥中超表達(dá)TaG6PDH和Ta6PGDH能夠增強(qiáng)植株的抗低溫能力。本實驗結(jié)果為解析Dn1抗寒機(jī)制提供了相應(yīng)的理論依據(jù),也為冬小麥抗寒分子育種奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S512.11
【部分圖文】：

圖 1-1 磷酸戊糖途徑示意圖Figure 1-1 The sketch map of pentose phosphate pathway植物非生物脅迫泛存在于植物、動物和原核生物中，G6PDH 催化過程為生物氮同化，還提供戊糖用于核酸合成[89,90]。一般來說，G6PDH檢測到，因此 G6PDH 可分為細(xì)胞質(zhì) G6PDH（Cy-G6PDH）和y-G6PDH 占據(jù)了植物體中該酶活性的 60%-85%[92]，并且 C6PDH 具有相似的動力學(xué)及分子性質(zhì)。通常 Cy-G6PDH 對還活性受 NADPH/NADP+比值的調(diào)節(jié)，并被 NADPH 競爭性抑 活性受糖傳感機(jī)制的調(diào)節(jié)，這種機(jī)制將根據(jù)植物中碳的狀態(tài)氨基酸的合成[97]。有研究顯示，擬南芥在鹽脅迫下，為了滿酶激酶 3（ASKα）能夠磷酸化 Thr-467，激活 Cy-G6PDH[98通過成熟蛋白和信號肽的比對發(fā)現(xiàn)了兩種不同亞型的質(zhì)6PDH），它們從共同的祖先基因進(jìn)化而來。P1-G6PDH 和 P異，P1-G6PDH 為（I/V/L）X（S/T/K）↓（S），而 P2-G6PDH 為（。P1-G6PDH 定位于植物葉綠體，P2-G6PDH 幾乎在所有植物化階段提供還原力[100]。光照下，為了避免無效的循環(huán)，P1-合作用的效率；黑暗下，抑制被解除，PPP 途徑被激活并釋

結(jié)果與分析3 結(jié)果與分析3.1 低溫脅迫下 TaG6PDH 和 Ta6PGDH 表達(dá)分析及酶活測定3.1.1 Dn1 總 RNA 提取及 cDNA 第一條鏈的合成用植物 RNA 提取試劑盒提取 Dn1 四個溫度（5℃、0℃、-10℃、-25℃）下分蘗節(jié)及葉片的總 RNA。隨后使用超微紫外分光光度計檢測 RNA 濃度及質(zhì)量，檢測結(jié)果 RNA 濃度、質(zhì)量均在合格范圍內(nèi)，同時也通過瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品 RNA 的質(zhì)量（圖 3-1），實驗結(jié)果也符合正常標(biāo)準(zhǔn)，可以用于后續(xù)實驗。再利用相應(yīng)的藥品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得每一個樣品的cDNA。A B

圖 3-4 低溫脅迫下 G6PDH 在分蘗節(jié)（A）和葉片（B）中的活性及 6PGDH 在分蘗節(jié)（C）和葉片（D）中的活性Figure 3-4 The activities of G6PDH in tillering node (A) and leaf (B) and the activities of6PGDH in tillering node (C) and leaf (D).2 目的基因的克隆及生物信息學(xué)分析.2.1 Dn1 中 TaG6PDH 和 Ta6PGDH 的克隆運(yùn)用 Primer5.0 設(shè)計 TaG6PDH、Ta6PGDH 基因克隆引物（表 3-2），以-10℃分蘗節(jié) cDNA模板，利用 PCR 技術(shù)分別對 TaG6PDH、Ta6PGDH 基因 CDS 序列進(jìn)行克�。▓D 3-5），PCR物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，泳道 1、2 為 TaG6PDH 目的條帶，泳道 3、4 為 Ta6PGDH 目的帶，長度分別為 1530 bp 和 1440 bp�；厥漳康臈l帶，對目的基因進(jìn)行測序，測序結(jié)果用NAMAN 進(jìn)行比對，比對結(jié)果如圖 3-6 所示，兩條克隆所得基因與小麥數(shù)據(jù)庫中基因序列似度達(dá) 99.61%和 98.13%，說明已成功獲得 Dn1 中 TaG6PDH 和 Ta6PGDH 基因 CDS 序列。表 3-2 TaG6PDH 和 Ta6PGDH 基因克隆引物Table3-2 TaG6PDH and Ta6PGDH cloning primers

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