在本課題的前期研究中,將來自于小立碗蘚的胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白樣蛋白(Gene ID:112292083,將該基因命名為DEHY)的基因分別轉(zhuǎn)入了鯤旱1號(簡稱H1)、鯤旱2號(簡稱H2)及旱糯3號(簡稱HN3)等三個(gè)品種的旱稻中,獲得大量陽性轉(zhuǎn)基因株系。本課題即是對旱稻轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行純合株系的篩選和進(jìn)一步分析鑒定,主要結(jié)果如下:1、在田間和實(shí)驗(yàn)室,利用噴施一定濃度的除草劑對不同天數(shù)的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行篩選,對噴施除草劑后全部存活的轉(zhuǎn)基因株系分別選取一定數(shù)量的單株,進(jìn)行目的基因PCR鑒定,篩選得到一批候選純合體株系,具體篩選結(jié)果為:DEHY轉(zhuǎn)化H1得到8個(gè),DEHY轉(zhuǎn)化H2得到20個(gè),DEHY轉(zhuǎn)化HN3得到17個(gè)候選純合體株系。2、利用Southern雜交,對候選純合體株系進(jìn)行拷貝數(shù)分析,篩選到2個(gè)單拷貝株系(將其編號為5-37、5-46)、6個(gè)二拷貝株系,12個(gè)多拷貝株系。3、利用半定量RT-PCR對單拷貝株系和二拷貝株系植株分別進(jìn)行目的基因的表達(dá)量分析,結(jié)果顯示2個(gè)單拷貝株系的目的基因表達(dá)量明顯高于二拷貝株系。4、利用一定濃度的PEG和NaCl脅迫,在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行幼苗期的抗逆性分析,結(jié)果顯示:NaCl脅迫條件下,5-37株系復(fù)水后存活率最高,達(dá)36%;PEG脅迫下,5-37、5-46株系復(fù)水后存活率最高,約為21%;隨后,利用0.5%NaCl的鹽池進(jìn)行轉(zhuǎn)基因株系田間的初步耐鹽性篩選,得到一個(gè)高耐鹽的轉(zhuǎn)基因株系,即為5-37株系。5、對以上1-2拷貝的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行TAIL-PCR插入位點(diǎn)分析,確定DEHY基因已經(jīng)穩(wěn)定整合到轉(zhuǎn)基因株系3-18基因組的6號染色體中。分析目的基因插入位點(diǎn)的基因組上、下游10Kbp范圍內(nèi)的幾個(gè)基因,分別針對野生型與3-18轉(zhuǎn)基因株系,對這幾個(gè)基因進(jìn)行定量PCR分析,結(jié)果顯示插入位點(diǎn)下游基因Os06g0663900的表達(dá)量明顯低于野生型植株。
【學(xué)位單位】：河北科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S511.6
【部分圖文】：

注：A、C 為轉(zhuǎn)基因株系，B 為野生型株系；噴施濃度 0.8mg/mL圖 2-1 田間除草劑噴施效果由圖可知中間為野生型材料，在噴施除草劑 3-5 天后全部變黃死亡，兩邊基因株系沒有死亡，說明該株系內(nèi)含有抗除草劑基因，由此可以說明目的基經(jīng)成功轉(zhuǎn)入旱稻基因組內(nèi)，并能夠正常表達(dá)。在田間大面積噴施除草劑后，

注：a 為除草劑前圖片，b 為除草劑后圖片；1、2 表示待測轉(zhuǎn)基因株系，W 表示野生型株系圖 2-2 除草劑前后對比圖從單株收獲的種子中，一個(gè)株系內(nèi)挑選 3-5 包，每包挑選 30 粒左右籽粒比較飽滿的種子萌發(fā)，等長到三葉一心時(shí)候，噴施濃度為 0.8mg/mL 的除草劑，3天后記錄苗子生長狀態(tài)，如下圖 2-3 所示。圖 a 為待鑒定的株系除草劑前，圖中

注：a 為除草劑前圖片，b 為除草劑后圖片；3、4 表示待測轉(zhuǎn)基因株系，W 表示野生型株圖 2-3 除草劑前后對比圖2.4.3 轉(zhuǎn) DEHY 候選純合株系 PCR 鑒定

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本文編號：2821569