蒲公英體內(nèi)含有萜類,酚類和多糖等活性成分。此外,已發(fā)現(xiàn)酚類中的綠原酸具有抗菌,抗氧化等作用。目前,植物次生代謝物生物合成的代謝調(diào)控是一種可能的手段,并可以改善高價值的次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。已知羥基肉桂酰-CoA:奎尼羥基肉桂�；D(zhuǎn)移酶(HQT)是植物中綠原酸合成途徑中的一個關(guān)鍵酶。本試驗利用植物無菌苗葉片為外植體,建立了丹東蒲公英(Taraxacum antungense Kitag.)再生體系,并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,建立了遺傳轉(zhuǎn)化體系,并將HQT基因?qū)氲降|蒲公英植物基因組內(nèi)。本試驗結(jié)果如下:1.本試驗以丹東蒲公英無菌苗作為葉片外植體來源,建立了丹東蒲公英再生體系。直接誘導(dǎo)葉片外植體不定芽再生的最佳培養(yǎng)基是MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉,最大的再生頻率為95.2±2.58%。然后通過對不定芽進行生根培養(yǎng)條件的篩選,得到生根的最佳培養(yǎng)基是1/2 MS+0.1 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉,最大生根率是99.0±0.58%。2.本試驗確立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的丹東蒲公英遺傳轉(zhuǎn)化方案:葉片外植體預(yù)培養(yǎng)時間48 h,根癌農(nóng)桿菌GV3101菌液OD_(600)濃度0.6左右,外植體感染持續(xù)時間10 min,AS濃度50 mg/L,共培養(yǎng)時間48 h這些參數(shù)用于本試驗轉(zhuǎn)化。最初侵染后的外植體在含有30 mg/L卡那霉素和500 mg/L頭孢霉素的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在抗性芽誘導(dǎo)后期頭孢霉素的濃度可選擇250 mg/L。最終,卡那霉素選擇抗性芽生根的濃度是15 mg/L。3.本試驗首先用PCR對抗性植株進行分析,表明HQT基因成功導(dǎo)入到丹東蒲公英的基因組中,轉(zhuǎn)化效率是5.7%。然后,通過q RT-PCR和HPLC的方法對轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株進行分析,發(fā)現(xiàn)3株轉(zhuǎn)基因植株葉片中的HQT基因相對表達(dá)量和綠原酸含量都比野生型植株要高。最后,本文得出3株轉(zhuǎn)基因植株中綠原酸含量分別是1.12,1.34和0.94 mg/g,野生型植株中綠原酸含量是0.74 mg/g。
【學(xué)位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S567.239
【部分圖文】：

圖 1 植物中綠原酸生物合成的 3 條路線Fig.1 Three routes of chlorogenic acid biosynthesis in plants1.5 本研究的目的意義本試驗研究了 MS 培養(yǎng)基和不同生長調(diào)節(jié)劑對蒲公英葉片外植體直接再生的影響。為了進行轉(zhuǎn)化，研究了卡那霉素和頭孢霉素濃度，葉片外植體預(yù)培養(yǎng)時間，OD600值，侵染時間，共培養(yǎng)時間和 AS 濃度這些參數(shù)對丹東蒲公英遺傳轉(zhuǎn)化的影響。此外，將控制綠原酸合成的 HQT（羥基肉桂酰-CoA：奎尼羥基肉桂�；D(zhuǎn)移酶）基因?qū)氲降|蒲公英基因組內(nèi)。本試驗方案可用于丹東蒲公英的快速體外增殖及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。本文提供了一個研究調(diào)控蒲公英中綠原酸合成途徑的分子機制的策略。此外，還有利于探索其他酚酸生物合成途徑，及綠原酸與其他酚類化合物相互作用的代謝機制。由于本課題組未有丹東蒲公英全基因組測序結(jié)果，并且在可用的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中未獲得可能與綠原酸合成相關(guān)的酶基因 HQT，在后期的試驗中多次嘗試克隆蒲公英中的HQT 基因，然而仍就沒有獲得蒲公英中 HQT 基因完整的 CDS（蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列）。

3 結(jié)果與分析3 結(jié)果與分析 NAA 對不定芽再生影響中，選擇圖 3 中的無菌苗葉片接種到 MS 培養(yǎng)基上，并補充不依據(jù)不定芽萌發(fā)情況確定單因素 6-BA 最佳誘導(dǎo)濃度，在表 1，單，確定 6-BA 最佳濃度為 2.0 mg/L，不定芽誘導(dǎo)效率是 73.0 ±1 5.6 ±0.15。通過單因素誘導(dǎo)不定芽效率最高的 6-BA（2.0 mg/L 組合，篩選出當(dāng)最佳結(jié)合培養(yǎng)基。6-BA（2.0 mg/L）和不同濃度的試驗發(fā)現(xiàn)葉外植體出明顯的愈傷組織及周圍有輕微的不定芽。3同時補充 2.0 mg/L 6-BA 和 0.2 mg/L NAA，不定芽誘導(dǎo)效率為 95數(shù)量（9.2 ±0.06）（圖 4）。表 1 和圖 2 是葉片外植體在不同激素。

Table1 Comparison of bud induction at different concentrations of 6-BA alone or in combination with NAA植物生長調(diào)節(jié)劑 Plant growthregulators (mg/L)不定芽再生效率 Percentageof shoot induction (%)每個外植體不定芽數(shù)量Number of adventitious6-BA NAAshoots/explant0 0 0±0i 0±0g0.5 0 10.2±0.66h 1.17±0.15i1.0 0 55.1±1.55f 1.9±0.12f1.5 0 64.1±1.49d 2.83±0.18d2.0 0 73.0±1.15c 5.6±0.15c3.0 0 59.7±1.23e 2.27±0.09e2.0 0.1 83.9±0.59b 8.07±0.15b2.0 0.2 95.2±2.58a 9.2±0.06a2.0 0.5 84.33±2.40b 5.93±0.09c2.0 1.0 26.8±1.11g 2.08±0.04ef注: 表 1 根據(jù)鄧肯多重比較檢測，字母表示在 P <0.05 比較物種內(nèi)處理之間的顯著差異Note:Table 1 according to the Duncan multiple comparison test, letters indicate significant differences between treatments within P < 0.05comparison species.

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本文編號：2820727