硒是一種重要的微量元素,存在于動物、植物和微生物中并且是動物和人體中谷胱甘肽過氧化物酶等的活性成分,具有抗氧化、抗衰老、提高人體免疫力等作用。不過食用硒也要適量,因?yàn)檫^量攝入會導(dǎo)致中毒,出現(xiàn)脫發(fā)、脫甲等現(xiàn)象。目前對硒元素的研究,主要集中在資源分布、富硒栽培、在植物中存在的形式以及其對植物生理生化的影響等方面,而在植物富硒分子機(jī)理方面研究較少。野葛(Pueraria lobata(willd.)Ohwi),為豆科葛屬多年生植物,是一種大宗重要中藥材,于2002年被國家衛(wèi)生部認(rèn)定為藥食兩用植物,也是一種富硒植物。野葛以其干燥的根入藥,稱為葛根,具有提高大腦記憶力、改善和治療心腦血管疾病等功效,其主要生物活性成分為異黃酮類化合物。本研究首先通過使用不同濃度亞硒酸鈉處理野葛幼苗,接著測定植株中硒含量和部分生理指標(biāo),篩選出最適的亞硒酸鈉濃度。然后借助轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究亞硒酸鈉作用下野葛中蛋白質(zhì)編碼基因的差異表達(dá)情況,明確差異表達(dá)基因所在的信號通路及其表達(dá)模式,根據(jù)注釋信息找到硒代謝和異黃酮代謝相關(guān)的編碼基因。最后利用小RNA測序技術(shù)揭示了亞硒酸鈉作用下野葛microRNA(miRNA)及其靶基因的差異表達(dá)情況,從而揭示野葛幼根響應(yīng)硒刺激的分子機(jī)制,為深入研究富硒野葛提供理論依據(jù)。本研究主要結(jié)果如下:1.用不同濃度的亞硒酸鈉溶液處理野葛幼苗,然后測定植株中的硒含量,初步明確了隨著亞硒酸鈉濃度的升高,葛根幼苗葉和莖中硒的含量表現(xiàn)為先增高后降低的模式,并在25 mg/L的濃度時植株中硒的含量達(dá)到最大值。2.根據(jù)硒含量測定結(jié)果,使用6種不同濃度的亞硒酸鈉溶液處理野葛幼苗,然后測量根長,可溶性糖、丙二醛的含量,以及超氧化物歧化酶的活性,綜合以上結(jié)果,明確了適宜的亞硒酸鈉溶液處理濃度為25 mg/L。3.用25 mg/L濃度的亞硒酸鈉溶液處理野葛幼苗,設(shè)置三次生物學(xué)重復(fù),分別于處理后第0、1、3、5、7、9天采集野葛幼根,使用改良的Trizol法提取RNA,建立轉(zhuǎn)錄組文庫,再利用Illumina HiSeq X ten平臺進(jìn)行測序,獲得了 18個堿基數(shù)目分別大于6,200,000,000 nt的文件。使用Trimmomatic軟件質(zhì)控后,再經(jīng)過Trinity軟件拼接共得到323,717個轉(zhuǎn)錄本,聚類去冗余后保留最長的序列,得到150,567條平均長度為624.31 bp的Unigene,其N50為1,135 bp,平均GC含量大于46%。接著對測序組裝的Unigene序列進(jìn)行功能注釋,發(fā)現(xiàn)有59,266、64,759、5,416、58,101、33,401、31,796 個基因分別在 NR、GO、KEGG、Swissprot、KOG和Pfam等數(shù)據(jù)庫得到了注釋。在KEGG數(shù)據(jù)庫中,共有9,746個基因在23個二級目錄下的215個途徑中得到了識別,其中包括29個硒代謝相關(guān)基因和41個異黃酮及其上游合成途徑基因。以0天作為對照,共獲得了 4,246個差異表達(dá)編碼基因,硒代謝途徑中有19個基因差異表達(dá),而在異黃酮及其上游途徑中則有9個基因差異表達(dá),并且這9個基因均為上調(diào)表達(dá)。本研究將轉(zhuǎn)錄因子與硒代謝途徑和異黃酮代謝途徑基因進(jìn)行共表達(dá)分析,以|R|0.75為閾值,發(fā)現(xiàn)了301個轉(zhuǎn)錄因子與硒代謝基因相關(guān),341個轉(zhuǎn)錄因子與異黃酮代謝基因相關(guān)。4.使用Illumina HiSeq X ten平臺進(jìn)行小RNA測序。再使用psRobot的軟件共鑒定出88個保守miRNAs,它們屬于26個miRNA家族;以及166個非保守miRNAs,它們屬于118個miRNA家族。對這些miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測,以期望值小于3.0為閾值,預(yù)測出了 2541個靶基因。對差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行功能富集后發(fā)現(xiàn):GO富集分析中前五位分別為“integral component of membrane”、“nucleus”、“ATP binding”、“transcription,DNA-templated”和“plasma membrane”;KEGG富集分析顯示125個差異表達(dá)miRNAs的靶基因富集到了 74條代謝途徑上,其中有69、23、20、13個靶基因分別富集到了“Metabolism”、“Genetic Information Processing”、“Environmental Information Processing”和“Cellular Processes”四個大類中,表明了野葛在亞硒酸鈉溶液處理后,幼根內(nèi)差異表達(dá)miRNA靶基因應(yīng)答具有復(fù)雜性。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S567.239
【部分圖文】：

逡逑我們對葛根幼苗處理第七天時葉和莖中的硒含量進(jìn)行了檢測，如圖２所示，逡逑我們發(fā)現(xiàn)隨著亞硒酸鹽處理濃度的升高，葛根幼苗葉和莖中砸的積累量整體上呈逡逑現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，且莖中的硒含量小于葉中的硒含量。在處理濃度為逡逑０．０５－５邋ｍｇ／Ｌ時，葛根幼苗葉和莖中硒的積累量較低，分別為１．３和０．７邋Ｈｇ／ｇ，在逡逑處理濃度為５－２５邋ｍｇ／Ｌ時，葛根幼苗葉和莖中硒的積累量較高，且在處理濃度為逡逑２５邋ｍｇ／Ｌ時達(dá)到最高，分別為５．７和２．５邋｜ｉｇ／ｇ，隨后葛根幼苗中硒的積累量開始降逡逑低。逡逑６．０逡逑＿邐Ｏ葉逡逑１１莖逡逑５．０邐■逡逑＾邋４０邐＿邐．邐Ｉ逡逑＇Ｓｎ逡逑３邋３．０邐■逡逑ｍ邐■邐■■逡逑２．０邐■邐Ｉ邐ｌｌ邐ｌｌ邐■逡逑＇ｆＣ邐ｎ邋ｒ－ｉ邐

本文編號：2814878