【摘要】：禾谷類作物成熟籽粒在人類飲食、牲畜養(yǎng)殖和工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。胚乳是籽粒的主體部分,被貯藏物質(zhì)淀粉和蛋白所充實。胚乳細胞、淀粉和蛋白的形態(tài)、數(shù)量和在籽粒中的空間分布影響著籽粒的產(chǎn)量和品質(zhì)。越來越多的研究表明,成熟籽粒不同部位的胚乳細胞、淀粉和蛋白表現(xiàn)為異質(zhì)性,尤以淀粉在高直鏈淀粉作物胚乳中的異質(zhì)性最為明顯。因此開展成熟籽粒不同區(qū)域胚乳細胞、淀粉和蛋白的研究越來越受到人們的重視。然而,由于現(xiàn)有切片技術(shù)不能夠?qū)Τ墒焱暾蚜＿M行切片,導(dǎo)致籽粒區(qū)域性的原位研究很難開展。本文建立了禾谷類成熟完整籽粒樹脂切片技術(shù)、非包埋切片技術(shù)和胚乳細胞圖片加工方法,并利用這些技術(shù)方法,研究了玉米發(fā)育穎果淀粉的時空積累和特性、高直鏈淀粉玉米胚乳淀粉的異質(zhì)性。該研究為禾谷類作物成熟籽粒不同區(qū)域的原位觀察和分析提供了技術(shù)方法,揭示了胚乳細胞、淀粉和蛋白在籽粒中的異質(zhì)性,豐富了淀粉在發(fā)育穎果中的時空積累和特性等知識,也為禾谷類作物品質(zhì)選育和籽粒加工利用提供重要參考。主要研究結(jié)果如下:1.禾谷類成熟完整籽粒樹脂切片技術(shù)的建立和應(yīng)用。首先,使用固定液對禾谷類成熟籽粒進行軟化和固定,并用鋒利刀片將籽粒進行橫切或縱切獲得完整籽粒組織塊;分別用梯度乙醇和LR White樹脂對籽粒組織塊進行逐級脫水和樹脂滲透;最后,將滲透好的籽粒組織塊包埋在純LR White樹脂中,獲得樣品的樹脂包埋塊。將包埋塊在超薄切片機上的樣品夾中夾緊,使用雙面刀片對包埋塊進行修塊,隨后用玻璃刀對樣品進行精修塊和干切片;使用銅鉤控制切出來的切片以防切片過度卷曲,導(dǎo)致粘在玻璃刀或包埋塊上,并將切片轉(zhuǎn)移至載玻片上進行展片和粘片。制備的完整籽粒樹脂切片被熒光增白劑、碘液和考馬斯亮藍等分別染色,能夠清晰顯示胚乳細胞壁、淀粉和貯藏蛋白,用以觀察和分析胚乳細胞、淀粉和蛋白的形態(tài)、數(shù)目和在籽粒中的空間分布。成熟水稻、玉米和小麥完整籽粒的切片結(jié)果表明,胚乳不同區(qū)域胚乳細胞和淀粉粒的形態(tài)存在顯著差異、貯藏蛋白主要分布在亞糊粉層區(qū)域。成熟完整籽粒樹脂切片方法也能對發(fā)育、發(fā)芽和蒸煮糊化的完整籽粒進行切片。2.禾谷類成熟完整籽粒非包埋切片技術(shù)的建立和應(yīng)用。首先將成熟籽粒夾在切片機樣品夾中,或?qū)⒄秤凶蚜悠返臉渲鬃鶌A在樣品夾中,用鋒利刀片將樣品表面修平,再用玻璃刀將樣品表面精修成鏡面。角質(zhì)或者透明籽粒直接在切片機上用玻璃刀進行干切片,但粉質(zhì)籽粒在切片前需將無色透明的指甲油涂抹在籽粒粉質(zhì)區(qū)域,經(jīng)過短時間的干燥凝固后即可切片。在切片過程中,利用銅鉤控制切出來的切片以防切片過度卷曲,粘在玻璃刀或包埋塊上,并將切片轉(zhuǎn)移至載玻片上進行展片和粘片。利用該方法制備的水稻、玉米、小麥和大麥完整籽粒的切片,經(jīng)過碘液染色,能夠清晰顯示淀粉的形態(tài)。觀察結(jié)果表明,禾谷類作物胚乳不同區(qū)域淀粉在形態(tài)和數(shù)量上存在異質(zhì)性,胚乳透明(或角質(zhì))和粉質(zhì)區(qū)域淀粉的形態(tài)和大小完全不同。高直鏈淀粉水稻和玉米完整籽粒的切片分析表明,胚乳不同區(qū)域的淀粉不僅形態(tài)和大小不同,而且淀粉的特性也具有顯著差異。本方法制備的非包埋切片,不僅能夠觀察淀粉的形態(tài),也能對淀粉的特性進行原位分析。另外,由于該方法能夠快速獲得成熟籽粒的切片,也可用于從大量禾谷類作物突變體中快速篩選淀粉形態(tài)發(fā)生改變的突變體。3.胚乳細胞圖片加工新方法的建立和應(yīng)用。首先在Photoshop軟件中打開拍攝的胚乳細胞圖片,將需要分析的胚乳細胞區(qū)域復(fù)制和粘貼到一個新建的黑色背景的畫布上。用Photoshop軟件中的“Pentool”精確勾勒胚乳細胞的輪廓,并保存為“Path”;用“Brushtool”對“Path”進行描邊,以便在圖像背景上清晰顯示胚乳細胞壁。復(fù)制黑色的背景圖層,并移至圖像圖層的上方;在背景圖層上對“Path”再次描邊,生成黑色背景下只有胚乳細胞壁的圖層,將該圖層保存為圖片。水稻、玉米和小麥成熟籽粒的樹脂切片,經(jīng)碘液、番紅-甲基紫或熒光增白劑染色獲得的胚乳細胞圖片,經(jīng)該方法的加工,不僅能夠清晰直觀顯示胚乳細胞的形態(tài),而且還能用各種形態(tài)分析軟件直接定量分析胚乳細胞的面積、長短軸和圓形度等形態(tài)參數(shù)。該方法聯(lián)合完整籽粒的樹脂切片法,不僅能夠?qū)坦阮愖魑锇l(fā)育和成熟籽粒不同區(qū)域的胚乳細胞進行形態(tài)觀察和形態(tài)學(xué)參數(shù)定量分析,而且還能對籽粒發(fā)育過程中胚乳組織的構(gòu)建過程進行分析。與形態(tài)分析軟件對拍攝的胚乳細胞直接進行形態(tài)學(xué)參數(shù)的定量分析方法相比,經(jīng)過該方法加工處理的圖片在形態(tài)學(xué)參數(shù)分析時具有耗時短、更精確和易操作等優(yōu)點。4.完整籽粒切片技術(shù)在玉米發(fā)育穎果淀粉時空積累研究中的應(yīng)用。利用本研究建立的完整籽粒樹脂切片方法,制備了普通玉米和糯玉米發(fā)育完整穎果的切片。利用碘液對切片染色用于觀察淀粉在發(fā)育穎果中的時空積累。結(jié)果表明,果皮淀粉為復(fù)粒淀粉,主要分布在果皮下部;隨著籽粒的發(fā)育,淀粉從果皮上部到下部逐漸降解。胚淀粉主要是單粒淀粉,在授粉后10天開始在盾片中合成和積累。胚乳淀粉在籽�？v向上由冠部向基部積累,在橫向上由胚乳中央向外積累,但淀粉在胚乳外部區(qū)域積累速度比胚乳內(nèi)部快。胚乳淀粉包含單粒和復(fù)粒淀粉,復(fù)粒淀粉主要分布在胚乳中央?yún)^(qū)域,在籽粒發(fā)育后期主要集中在胚乳下部。分離授粉后20天的胚乳、胚和果皮淀粉,結(jié)構(gòu)特性測定表明,普通玉米果皮淀粉的直鏈淀粉含量最高,其次是胚乳淀粉,而胚淀粉的直鏈淀粉含量最低;糯玉米胚乳淀粉不含直鏈淀粉,果皮和胚淀粉的直鏈淀粉含量與普通玉米胚淀粉類似;普通玉米和糯玉米果皮、胚和胚乳淀粉均為A-型晶體。淀粉合成相關(guān)基因的表達分析表明,參與直鏈淀粉合成的顆粒結(jié)合淀粉合成酶Ⅰ和Ⅱ分別僅在胚乳和胚中表達,但同時都在果皮中表達;參與支鏈淀粉合成的可溶性淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉脫分支酶在胚乳、胚和果皮中都有表達,但表達的量有顯著差異。5.完整籽粒切片技術(shù)在高直鏈玉米胚乳異質(zhì)淀粉粒研究中的應(yīng)用。本研究以直鏈淀粉含量為19.2%、23.0%、36.4%、41.8%和62.5%的玉米自交系為材料,研究玉米胚乳淀粉的異質(zhì)性。形態(tài)分析表明,玉米淀粉包含單顆粒、雙相、聚合體和細長形等不同形態(tài)的淀粉粒,其中單顆粒淀粉主要存在于直鏈淀粉含量為19.2%和23.0%的玉米中,雙相淀粉主要存在于直鏈淀粉36.4%和41.8%的玉米中,而聚合體和細長形淀粉主要存在于直鏈淀粉含量為62.5%的玉米中。通過對完整籽粒樹脂切片的觀察發(fā)現(xiàn),隨著直鏈淀粉含量的升高,玉米胚乳的外側(cè)區(qū)域和中央?yún)^(qū)域下部的淀粉粒逐漸變小,逐漸出現(xiàn)聚合體和細長形淀粉;而在胚乳中央?yún)^(qū)域上部則分布有單顆粒、雙相、聚合體和細長形淀粉。在直鏈淀粉含量為19.2%至41.8%的玉米中,胚乳不同區(qū)域淀粉的直鏈淀粉含量不同,胚乳中央?yún)^(qū)域上部淀粉的直鏈淀粉含量比胚乳外側(cè)區(qū)域淀粉和中央?yún)^(qū)域下部淀粉的直鏈淀粉含量低,且隨著直鏈淀粉含量的升高,這種差異逐漸增大;但胚乳不同區(qū)域淀粉的晶體結(jié)構(gòu)類型沒有發(fā)生變化。在直鏈淀粉含量為36.4%的玉米中,雙相淀粉主要分布在發(fā)育胚乳的中央?yún)^(qū)域,隨著穎果的發(fā)育,雙相淀粉逐漸集中到胚乳中央?yún)^(qū)域的上部。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S513
【圖文】：

淀粉主要是由線性的直鏈淀粉（含量一般為１８？３３％）和高度分支的支鏈淀粉（含量一般逡逑為邋６７？８２％）組成的半晶體顆粒（圖邋１－１）邋（Ｗａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１４；邋Ｗａｎｇ邋＆邋Ｃｏｐｅｌａｎｄ，邋２０１５）。淀粉粒逡逑的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，常被分為５級結(jié)構(gòu)層次（圖１－１－Ａ）。第１級和第２級結(jié)構(gòu)是直鏈淀粉和支逡逑鏈淀粉分子結(jié)構(gòu)。直鏈淀粉主要是由ｃｘ－１，４糖苷鍵連接的ｏｔ－Ｄ－葡萄糖單元組成的線性多糖，逡逑含有少量分支，相對分子質(zhì)量在１0５￣１0６范圍內(nèi)，聚合度在５００￣６０００范圍內(nèi)（Ｄｅｌｃｏｕｒｅｔａｌ．，逡逑２０１０）。支鏈淀粉主要由ａ－１，邋６糖苷鍵連接的線性分支組成，相對分子質(zhì)量在１０７？１０９之間，逡逑其中的線性分支由ａ－１，邋４糖苷鍵連接的ａ－Ｄ－葡萄糖單元組成（Ｂｕｌ６ｏｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，１９９８）。支鏈淀粉逡逑側(cè)鏈進一步分為Ａ鏈、Ｂ鏈和Ｃ鏈（圖１－１－Ｂ）。Ａ鏈?zhǔn)欠植荚谧钔鈱記]有分支的側(cè)鏈，聚逡逑合度在６？１２之間。Ｂ鏈有一條或多條側(cè)鏈，根據(jù)貫穿簇狀結(jié)構(gòu)的層數(shù)，又被分為Ｂｌ、Ｂ２、逡逑Ｂ３和Ｂ４鏈等，其中Ｂ１鏈聚合度在１３？２４之間，Ｂ２鏈聚合度在２５？３６之間，Ｂ３和Ｂ４鏈逡逑聚合度在３７以上（Ｈａｎａｓｈｉｒｏ邋ｅｔ邋ａｌ．

括邋ＡＤＰＧ邋焦a愃嶧福ǎ粒模繡澹紓歟酰悖錚螅邋澹穡潁錚穡瑁錚螅穡瑁錚潁歟幔螅�，Ａ啃ａｓｅ）、淀粉恒娚酶（阳ａ}悖楨澹螅睿簦瑁幔螅�，辶x希櫻櫻�、淀粉贩N福ǎ櫻簦幔潁悖楨澹猓潁幔睿悖瑁椋睿玨澹澹睿恚�，邋褦n牛┖偷矸弁遜種福ǎ櫻簦幔潁悖楨澹洌澹猓潁幔睿悖瑁椋睿玨澹澹睿恚�，辶x希模攏牛ㄍ跡保玻╁澹ǎ危幔耄幔恚酰潁�，邋２００２）。Ａ啃ａｓｅ催化覝o姿崞咸煙牽ǎ牽保校┳粒模釁咸煙清義希ǎ粒模校紓歟酰悖錚螅�，ＡＤＰ咯邋（Ｎａｋａｍｕ}�，邋２０１�(dān)�。因此Ａ啃ａｓｅ催化淀粉恒娚碘c鶚疾街韜凸丶街�，辶x鮮塹矸酆銑傻南匏倜�，影响讙佲傉恒娚淀粉的量（ＫｅP歟歟澹蟈澹澹翦澹幔歟�，邋２００２）。延通过将ＡＤＰＷl義俠吹鈉咸煙腔拋頻狡暇厶且锏姆腔乖閱┒�，磦蝤实现葡虩熐链惦y由臁＃櫻幽芄槐誨義轄徊椒治帕＝岷系矸酆銑擅福ǎ牽潁幔睿酰歟澹猓錚酰睿溴澹螅簦幔潁悖楨澹螅睿簦瑁幔螅�，邋繑n櫻櫻┖涂扇芐緣矸酆銑懾義廈福ǎ櫻錚歟酰猓歟邋澹螅簦幔潁悖楨澹螅睿簦瑁幔螅�，邋褭褭雪。繑n櫻又饕涸鷙銑芍繃吹矸郟治牽攏櫻櫻珊停牽攏櫻櫻桑閃藉義俠�，分柄�?wù)斶葯褒x桑舨刈櫓鴕鍍裙夂獻櫓蟹⒒庸δ埽ǎ疲酰輳椋簦徨澹﹀澹裕幔椋潁�，邋１９９８Ｕd澹危幔耄幔恚酰潁徨澹澹翦義希幔歟�，邋１９９８）。褭寻b涸鷸Я吹矸鄯種Я吹難由歟芄喚扇芐緣那疤邐鎦剩粒模校塹鈉咸腔佩義獻頻劍幔

本文編號：2814696