棉花作為主要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一直占有重要的地位,野生棉中的雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)屬于二倍體棉種,同時(shí)也是異源四倍體D亞組的供體種,具有抗鹽堿、抗蟲、抗旱、抗黃萎病等特性。雷蒙德氏棉的全基因組測(cè)序已完成,為深入研究棉花基因組以及棉花優(yōu)異的種質(zhì)資源挖掘打下堅(jiān)實(shí)地基礎(chǔ)。順式作用元件與反式作用因子之間的相互作用控制著真核生物基因的表達(dá)與調(diào)控,通常順式作用元件所在位置的染色質(zhì)對(duì)DNase I高度敏感,即DNase I高敏感位點(diǎn)(DNase I hypersensitive sites,DHSs)。研究發(fā)現(xiàn)DHSs幾乎包括了所有的活性調(diào)節(jié)元件,如增強(qiáng)子、抑制子、絕緣子以及啟動(dòng)子中的主要功能位點(diǎn)。隨著高通量測(cè)序的不斷發(fā)展,通過DNase I酶切結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)(DNase-seq)可以實(shí)現(xiàn)全基因組DHSs位點(diǎn)的鑒定,對(duì)挖掘特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、探明基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有重要意義。本文基于已有的水稻和擬南芥中DNase I高敏感位點(diǎn)的鑒定方法,完成了適用于雷蒙德氏棉的DHSs文庫構(gòu)建方法優(yōu)化;以雷蒙德氏棉的幼葉和愈傷組織作為材料,成功構(gòu)建了以雷蒙德氏棉的幼葉和愈傷組織的DNase I高敏感位點(diǎn)文庫,并完成了DHSs文庫的測(cè)序。研究成果如下:(1)雷蒙德氏棉幼葉和愈傷組織DHSs文庫構(gòu)建方法的優(yōu)化。針對(duì)雷蒙德氏棉細(xì)胞中含有的次生代謝物質(zhì)較多,細(xì)胞核容易被氧化,在細(xì)胞核提取緩沖液中添加了2%(m/v)的PVP40后提取的細(xì)胞核較為純凈。另外,為了更好的去除細(xì)胞核中的葉綠體等雜質(zhì),在細(xì)胞核洗滌緩沖液中添加了0.4%(v/v)的Triton X-100,可以很好的去除葉綠體等雜質(zhì)的影響且不引起細(xì)胞核的降解。由于棉花基因組較大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜,所以在構(gòu)建DHSs的文庫時(shí)對(duì)Adaptor 1和Adaptor 2的連接條件做了探討,發(fā)現(xiàn)當(dāng)Adaptor 1與高分子量DNA之間的最佳連接比例為1:8時(shí)連接效果最佳,Adaptor 2連接時(shí)溫度在25℃時(shí)連接效率最高。DHSs的文庫構(gòu)建成功后,對(duì)文庫做了單克隆驗(yàn)證,隨機(jī)挑取單克隆經(jīng)測(cè)序分析,都獲得了20 bp左右的酶切片段,證明了已經(jīng)獲得的正確的DHSs文庫。(2)雷蒙德氏棉幼葉和愈傷組織DHSs的生物信息學(xué)分析。經(jīng)過高通量測(cè)序后,使用bioperl軟件包去除接頭序列,bowite軟件讀段定位,最后用F-seq鑒定DHSs。在雷蒙德氏棉幼葉和愈傷組織中分別得到了72,466、37,898和78,461、102,056個(gè)DHSs。初步分析了這些DHSs在染色體上的大致分布,發(fā)現(xiàn)在雷蒙德氏棉的幼葉和愈傷組織中的DHSs主要集中在染色體的兩端。通過進(jìn)一步分析這些位點(diǎn)所在的區(qū)域及占比,發(fā)現(xiàn)DHSs主要分布在以下區(qū)域中:蛋白質(zhì)編碼區(qū)(21%-29%)、內(nèi)含子(3%-5%)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游200 bp(7%-12%)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游200-1000 bp(7%-9%)、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)下游200 bp(2%-3%)、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)下游200-1000 bp(5%-6%)、5'UTR(12%-17%)和3'UTR(4%-8%),并且幼葉和愈傷組織中有57%的特異性DHSs存在。最后,發(fā)現(xiàn)雷蒙德氏棉中DHSs的豐度主要在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游500 bp內(nèi),DHSs的分布主要在轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)下游2.5 kb內(nèi)。在愈傷組織中雖然檢測(cè)到了更多的DHSs,但DHSs在雷蒙德氏棉幼葉和愈傷組織中的大致分布是相同的。本研究鑒定出了雷蒙德氏棉幼葉和愈傷組織中的DHSs,為后期研究相關(guān)的組蛋白修飾提供支持。
【學(xué)位單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S562;Q943.2
【部分圖文】：

圖 2-1 DNase I 超敏感位點(diǎn)的分析流程圖Fig. 2-1 DNase I hypersensitive site analysis flow chart.3 本章小結(jié)本章介紹了雷蒙德氏棉的幼葉與愈傷組織的獲取途徑，以雷蒙德氏棉的幼葉為例敘述了 DNase I 切割細(xì)胞核和構(gòu)建 DHSs 文庫過程中的主要步驟及試劑的配制方法HSs 文庫構(gòu)建后進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析，成為一種高效快捷鑒定基因組中順式元件的方法，除了在一些動(dòng)物和模式植物上有較為成熟的研究應(yīng)用外，在基因組較多倍體植物中研究應(yīng)用還具有一定的難度。棉花是全球最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，也究植物單細(xì)胞發(fā)育最理想的模式植物。雷蒙德氏棉是公認(rèn)的異源四倍體 D 亞組供之一，具有提高纖維品質(zhì)、抗旱、抗病及抗蟲的潛質(zhì)。隨著雷蒙德氏棉基因組測(cè)序成，構(gòu)建雷蒙德氏棉 DHSs 圖譜，開展重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)理研究顯得重要。本研究就雷蒙德氏棉 DHSs 文庫的構(gòu)建，形成了一套較為成熟的技術(shù)方法，

細(xì)胞核提取液中 PVP40 對(duì)膠塊質(zhì)量VP40 on Quality of Plastic Blocks in CPVP40 所做的膠塊，b：為加 PVP40 made without PVP4, b: is a plastic blo X-100 的量也做了詳細(xì)的探究。IB 緩沖液中加入 Triton X-100 B，用不同濃度的 Triton X-100黃色、白色，混合 2%（m/v）、白色（圖 3-2）。但是淺綠色取的細(xì)胞核并不純凈。而淡黃色的細(xì)胞核較為純凈，然而過多的的不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致細(xì)胞核和染織中最終確定加入 Triton X-10

圖 3-2 細(xì)胞核洗滌液中 Triton X-100 對(duì)膠塊質(zhì)量的影響ffect of Triton X-100 on the quality of plastic blocks in nuclear was：a、b、c 分別表示 Triton X-100 的終濃度為 0.2%、0.4%和 0.ate the final concentration of Triton X-100 is 0.2%, 0.4% and 0.8%從 DNase I 酶切位點(diǎn)產(chǎn)生的測(cè)序讀數(shù)用于鑒定 DNase-se裂位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致假陽性測(cè)繪結(jié)果。為了使細(xì)胞核或染色質(zhì)要將在細(xì)胞核分離和洗滌緩沖液中加入 0.5 M 蔗糖以維進(jìn)行離心。經(jīng)過以上處理，所提取的細(xì)胞核質(zhì)量較高，se I 用量的選擇是 DHSs 文庫構(gòu)建中較為關(guān)鍵的步驟之一，因?yàn)?DHSs 起始濃度，而且要保證高質(zhì)量的完整酶切位點(diǎn)。本研究酶切濃度以達(dá)到最佳酶切效果。本研究首先進(jìn)行了預(yù)實(shí)

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1 陳海峰,黃迪;鼻咽癌患者血清中抗Epstein-Barr病毒特異性DNA酶抗體檢測(cè)方法的探討[J];中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1988年01期

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