發(fā)布時間：2020-08-21 01:46

【摘要】：馬鈴薯是我國主要的四大作物之一,光合產(chǎn)物糖類的轉運為馬鈴薯塊莖形成提供物質(zhì)基礎,馬鈴薯葉片中同化產(chǎn)物的長距離運輸及卸載是關鍵環(huán)節(jié)。糖轉運蛋白SWEET可以雙向轉運糖類,還在生長發(fā)育、代謝過程和脅迫中發(fā)揮重要的功能。本實驗根據(jù)馬鈴薯雙單倍體全基因組數(shù)據(jù)庫作為數(shù)據(jù)來源,結合擬南芥和番茄SWEET基因家族,對馬鈴薯糖轉運蛋白(StSWEET)家族進行鑒定和系統(tǒng)的生物信息學分析,并研究了StSWEET家族在青薯9號馬鈴薯中不同組織的表達譜;StSWEET基因家族在青薯9號馬鈴薯的生物脅迫與非生物脅迫下的表達�；诒磉_情況,對StSWEET11和StSWEET16b基因進行了同源克隆及功能分析。1、本文分析得到馬鈴薯StSWEET家族中有33個基因,命名自StSWEET1-StSWEET17;與已發(fā)表的番茄SlSWEET家族29個基因、擬南芥AtSWEET家族35個基因進行聚類。SWEET家族被聚為4個亞族,第一亞族有6個,第二亞族有32個,第三亞族中含有51個,馬鈴薯SWEET家族占有19個,第四亞族僅有2個,馬鈴薯大部分基因歸于第三亞族�；蚪Y構分析表明每個開放閱讀框的內(nèi)含子數(shù)量都不一樣,其結構比較保守。StSWEET基因家族基本成簇分布在10條馬鈴薯染色體上,10號和11號染色體沒有分布,StSWEET12d基因目前還未被定位。StSWEETs蛋白家族具有10個保守基序,同一亞族中的蛋白含有相似的保守基序組成,其在每亞族中具有相似的功能。啟動子預測分析表明馬鈴薯SWEET蛋白與細胞生長、發(fā)育、次生代謝以及響應生物與非生物脅迫等相關。2、利用qRT-PCR技術分析馬鈴薯StSWEET基因家族在青薯9號中不同組織表達譜。研究表明大部分StSWEET基因家族在不同組織中呈現(xiàn)特異性表達,在某一組織的特異性表達可能參與了組織的生長發(fā)育,調(diào)控了相應的功能。StSWEET11基因在葉中特異性高表達,StSWEET16b基因在花中特異性高表達。在根中StSWEET10c的表達最高,StSWEET12e低表達;在莖中,StSWEET1h的高表達,StSWEET1f表達量最低;StSWEET11在葉中表達較高,StSWEET17表達量最低;在花中StSWEET1e高表達,StSWEET1f表達較低;在塊莖中StSWEET1d表達較高,StSWEET12e表達低平;在匍匐莖中,StSWEET12c在匍匐莖中表達較高,而StSWEET17低表達。3、利用qRT-PCR技術分析馬鈴薯StSWEET基因家族在青薯9號的生物脅迫(晚疫病病菌浸染葉片)與非生物脅迫(葡萄糖、果糖和蔗糖處理)下的表達。研究表明StSWEET11基因響應了晚疫病病菌的生長,也對蔗糖較敏感;StSWEET16b基因與晚疫病病菌的生長緊密相關,對果糖和蔗糖稍敏感。在馬鈴薯晚疫病病菌誘導下,StSWEET10c和StSWEET10d在24h時達到最高表達,尤其StSWEET11的表達量顯著上調(diào)。StSWEET1d、StSWEET1e、StSWEET2b、StSWEET10a和StSWEET12b的表達量存在下降趨勢。在糖脅迫過程中,在根中,StSWEET3,StSWEET10b,StSWEET2c,StSWEET16b和StSWEET16c在葡萄糖脅迫后的表達下調(diào);StSWEET12c在葡萄糖和果糖脅迫后上調(diào),然而在蔗糖脅迫后卻呈現(xiàn)下調(diào);StSWEET16a僅在果糖脅迫后上調(diào)。在莖中,StSWEET16a,StSWEET17,StSWEET1e和StSWEET10a在葡萄糖脅迫后上調(diào);在果糖和蔗糖的脅迫下,StSWEET11,StSWEET1b,StSWEET12e,StSWEET1f,StSWEET12d,StSWEET1c和StSWEET1d上調(diào)。在葉片中,StSWEET1i,StSWEET10c和StSWEET2a在蔗糖脅迫后上調(diào),StSWEET2c在蔗糖脅迫后下調(diào)。4、基于基因表達情況,選取在馬鈴薯青薯9號中克隆StSWEET11基因和StSWEET16b基因。其StSWEET11的CDS為903 bp,編碼301個氨基酸,分子量為33591.42 Da,等電點為9.29,具有7個跨膜域,含有兩個MtN3/saliva保守結構域。StSWEET16b的CDS為786 bp,編碼262個氨基酸,分子量為28838.13Da,等電點為9.66,具有6個跨膜域,含有一個MtN3/saliva保守結構域。利用Gateway技術分別構建StSWEET11基因和StSWEET16b基因的表達載體,分別以LBA4404農(nóng)桿菌感受態(tài)介導進行遺傳轉化煙草,StSWEET11基因,得到了52株轉化苗;StSWEET16b基因,得到了48株轉化苗。
【學位授予單位】：青海大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S532
【圖文】：

圖 1.1 SWEET 蛋白的結構[3,12]Fig. 1.1 Structure of the SWEET protein在擬南芥中發(fā)現(xiàn) SWEET 蛋白有 4 個亞家族分支，其中氨基酸的同源相似比例在 27%和 80%的范圍內(nèi)[10,21]。在綠色熒光亞細胞的分析發(fā)現(xiàn)，對于植物中大部分的 SWEETs 家族基因能夠細胞質(zhì)膜上被定位。用納米傳感器運輸?shù)姆椒▽嶒灠l(fā)現(xiàn)，SWEET 家族具有雙向糖轉運蛋白的作用[13,18]。在擬南芥的特別，第Ⅰ和Ⅱ亞家族分支中發(fā)現(xiàn) SWEETs 蛋白能夠作為轉運單糖，而第Ⅲ亞家族分支中發(fā)現(xiàn) SWEETs 蛋白能夠對蔗糖作用，作為轉運二糖。在第Ⅳ分支中，擬南芥中的AtSWEET16和AtSWEET17蛋白能對果糖起雙向作用進而保持維持在根部中的果糖。對于韌皮部中的薄壁細胞再向周圍韌皮部主要依靠 AtSWEET11 和AtSWEET12 對蔗糖的作用和轉運[21,22]。但是在對 AtSWEET16 進行過表達分析分析，對蔗糖、果糖和葡萄糖的轉運水平上出現(xiàn)變化。而異源表達 AtSWEET17 后再在突變體中葉片上出現(xiàn)果糖的增加，可能是在葉片上液泡中出來的[23,24]�？傊�，AtSWEET17 在對果糖輸出作用有重要的功能。對馬鈴薯中 SWEETs 蛋白家

產(chǎn)生更高的病菌，對植株進行危害而感病。而抗病的水稻品種 xa13 基因不僅能產(chǎn)生氣體的對病原菌作用的因子（AvrXa7、PthXo3 等），而且還能引起 Os11N3的表達產(chǎn)生抗性[32,33]。Os11N3 基因（也稱為 OsSWEET14）與 OsSWEET11 能夠產(chǎn)生較為相似作用（圖 1.2）。Os11N3 基因的表達升高最先將蔗糖運往外質(zhì)體，致使病原菌可能最小化的引起防御反應[34,35,36]。研究發(fā)現(xiàn)，通過克隆水稻的白葉枯病的基因，發(fā)現(xiàn) xa25 基因（隱性抗�。�，發(fā)現(xiàn)與 OsSWEET14 基因具有相似的同源的蛋白，可能 SWEETs 基因家族相互協(xié)調(diào)產(chǎn)生抗病作用[37]。在擬南芥 SWEETs 基因家族成員中，AtSWEET2、AtSWEET4、AtSWEET7、AtSWEET8、AtSWEET10、AtSWEET12 和 AtSWEET15 被病原菌丁香假單胞菌引起上調(diào)表達[21,36]。在辣椒中，容易感病的植株收到辣椒黃單胞菌的浸染后，UPA16 (MtN3/saliva/SWEET 類型基因）被調(diào)節(jié)表達上升[13,33]。同時，能誘導擬南芥 AtSWEET4、AtSWEET15 和 AtSWEET17 基因表達變化能被灰霉病菌影響；AtSWEET11 和 AtSWEET12 基因表達上調(diào)在二孢白粉菌的作用下[38,39]。Siemens等[40]人研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中 SAG29/AtSWEET15 基因能表達上調(diào)，在受到根腫菌刺激后�？傊�，SWEET 家族成員能夠在植物防御和抗病過程中有作用[26,27,29]。

StSWEET16c PGSC0003DMT400063717 gene:PGSC0003DMG400024764 transcript:PGSC0003DMT400063717StSWEET17 PGSC0003DMT400063711 gene:PGSC0003DMG400024762 transcript:PGSC0003DMT4000637112.3.3 馬鈴薯 StSWEET 蛋白家族的系統(tǒng)進化樹的構建將鑒定的馬鈴薯 StSWEET 的氨基酸序列，與番茄 SWEET 和擬南芥 SWEET同時進行系統(tǒng)進化樹的構建。運用軟件 MEGA7.0，采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹。結果顯示，如圖 2.1，馬鈴薯 StSWEET 蛋白家族 33 個，與番茄 SlSWEET 家族29 個、擬南芥 AtSWEET 家族 35 個進行聚類，SWEET 家族被聚為 4 個亞族，進化過程中，結構和功能發(fā)生變化，但大部分基因關系較近，比較保守。第一亞族有 6 個，第二亞族有 32 個，第三亞族中含有 51 個，馬鈴薯 SWEET 家族占有19 個，第四亞族有 2 個，馬鈴薯大部分基因歸于第三亞族。

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1 李明;馬鈴薯糖轉運蛋白StSWEET基因的克隆及功能分析[D];青海大學;2019年

本文編號：2798739