【摘要】：小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物,在生長(zhǎng)過程中經(jīng)常遭受環(huán)境因素,如干旱、高溫、鹽漬和重金屬的影響,致使其嚴(yán)重減產(chǎn)。LEA蛋白作為植物遭受逆境脅迫的誘導(dǎo)蛋白,可以減輕植物細(xì)胞受到的損害,從而對(duì)植物起到保護(hù)作用。脫水素屬于LEA蛋白第二亞家族成員,具有高度親水性,在植物抵抗干旱脅迫中起到重要作用。本文以鄭引1號(hào)小麥為材料,克隆得到WZY1-2、WZY2(小麥脫水素蛋白)基因,通過構(gòu)建原核表達(dá)載體與誘餌載體,通過Pull-down技術(shù)和酵母雙雜交技術(shù),篩選與脫水素WZY1-2、WZY2互作的蛋白,進(jìn)一步研究該蛋白的功能。其結(jié)果為深入解析小麥抗旱的分子生物學(xué)機(jī)制、小麥分子育種等研究奠定基礎(chǔ)。通過研究獲得以下結(jié)果:1.從小麥鄭引1號(hào)中克隆到脫水素基因WZY1-2、WZY2,基因編碼區(qū)長(zhǎng)789bp、459bp,分別編碼262、152個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為28KD、15.522KD,屬于SK3、YSK2型脫水素。成功構(gòu)建原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),通過誘導(dǎo)條件的篩選發(fā)現(xiàn)WZY1-2的最佳表達(dá)條件為在37℃下0.1mM的IPTG誘導(dǎo)6h,WZY2的為在37℃ 下0.2mM 的IPTG 誘導(dǎo)10h。2.GST層析柱純化WZY1-2、WZY2后,通過Pull-down從小麥總蛋白中篩選到能與WZY1-2潛在互作蛋白有132個(gè),其中96個(gè)為未知結(jié)構(gòu)蛋白,36個(gè)為已知結(jié)構(gòu)蛋白;與WZY2潛在互作蛋白有75個(gè),其中68個(gè)為未知結(jié)構(gòu)蛋白,7個(gè)為已知結(jié)構(gòu)蛋白。選取與WZY1-2互作且與抗逆相關(guān)蛋白7個(gè),與WZY2互作且與抗逆相關(guān)的蛋白6個(gè),通過構(gòu)建誘餌載體與獵物載體,在酵母菌株Y2HGold中進(jìn)一步驗(yàn)證其互作。3.通過構(gòu)建PGBKT7-WZY1-2、PGBKT7-WZY2載體,轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold驗(yàn)證其自激活性與毒性作用,發(fā)現(xiàn)當(dāng)AbA的濃度為200ng/ml時(shí)都能抑制酵母的本底表達(dá),并且WZY1-2、WZY2在酵母中表達(dá)時(shí)對(duì)酵母無毒性作用。4.將cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化含有PGBKT7-WZY2的Y2HGold酵母菌株中,通過檢測(cè)其轉(zhuǎn)化效率,發(fā)現(xiàn)達(dá)到8.7×106個(gè)單克隆,表明已將幾乎全部的文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)去。通過后續(xù)曬選實(shí)驗(yàn),總共得到21個(gè)互作蛋白,其中有9個(gè)是與抗逆相關(guān)的蛋白,需要進(jìn)一步在酵母中驗(yàn)證其互作性。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S512.1
【圖文】：

ＰＧＥＸ６Ｐ－１－ＷＺＹ１－２、ＰＧＥＸ６Ｐ－１－ＷＺＹ２的表達(dá)菌ＢＬ２１（ＤＥ３）用不同濃度終濃度的逡逑ＩＰＴＧ（０．１、０．２、０．５、ＩｍＭ）分別處理（２、４、６、８、１０、１２ｈ）小時(shí)ｇ收集對(duì)照菌和童組菌逡逑蛋良用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳對(duì)誘導(dǎo)后的蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果（見

逡逑圖２－５ＷＺＹｌ－２（ａ）、ＷＺＹ２（ｂ）在３７°Ｃ條件下，不同ＩＰＴＧ濃度不同T間誘導(dǎo)下的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳圖逡逑１：對(duì)照；２：對(duì)照誘導(dǎo)６ｈ逡逑Ｆｉｇ邋２－５邋Ｔｈｅ邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋ｔｅｓｔ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＷＺＹｌ－２（ａ）ｖ邋ＷＺＹ２（ｂ）ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ＩＰＴＧ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｔｉｍｅ邋ａｔ逡逑３７°Ｃ逡逑１邋：邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋２：邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ邋６ｈ逡逑２．４．３邋ＧＳＴ邋Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ篩選及質(zhì)譜鑒定逡逑將在最適誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)的重組蛋白ＧＳＴ－ＷＺＹ１－２和ＧＳＴ－ＷＺＹ２處理后分別等體逡逑積過谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱１、２號(hào)和３、４號(hào)進(jìn)行純化，同時(shí)將空的ＧＳＴ蛋白（對(duì)照）逡逑同樣處理后過谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱５號(hào)，然后將提取的小麥葉片總蛋白處理后等體積逡逑過２、４、５號(hào)柱子，進(jìn)行互作蛋白的篩選。將流出液進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳檢測(cè)，結(jié)果見逡逑圖２－６。將蛋白溶液進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。去掉對(duì)照所含的蛋白之后，剩余的則是篩選的靶蛋逡逑白。根據(jù)結(jié)果顯示，與ＷＺＹ１－２潛在互作的蛋白有１３２個(gè)，其中９７個(gè)為未知結(jié)構(gòu)蛋白；逡逑３５個(gè)為已知結(jié)構(gòu)蛋白（表２－２）；篩選與ＷＺＹ２潛在互作的蛋白７５個(gè)，其中６８?jìng)�(gè)為未知逡逑結(jié)構(gòu)蛋．白＃邋７個(gè)為已知結(jié)構(gòu)蛋白（表２－３）

ＰＧＢＫＴ７－ＷＺＹ２已成功，首先挑取陽(yáng)性克隆菌，用特異性引物進(jìn)行菌落ＰＣＲ鑒定。為逡逑了進(jìn)一步檢測(cè)構(gòu)建重組質(zhì)粒的正確性，對(duì)重組質(zhì)粒分別進(jìn)行單酶切（ＥｃｏＲＩ）和雙酶切逡逑（ＥｃｏＲＩ和Ｓａｉｌ），用１％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，結(jié)果如圖２－７。提取質(zhì)粒測(cè)序，逡逑結(jié)果與目的基因一致，證明載體構(gòu)建成功。逡逑ＷＺＹ１－２逡逑Ｗ邐＾邐＾邐＾邐卜邐

本文編號(hào)：2791414