【摘要】：穿心蓮為閉花授粉植物,由于其品種單一、多樣性低導(dǎo)致產(chǎn)量下降、有效成分含量降低等問題。開展高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)新種質(zhì)的培育研究迫在眉睫。傳統(tǒng)方法選育新品種一般要經(jīng)過5~7年自交,才能育出穩(wěn)定的品種。體外雄核發(fā)育是誘導(dǎo)游離小孢子(花粉)離開原來配子體的單細(xì)胞體外發(fā)育途徑。單倍體育種可以極大縮短育種周期,有助于選育高產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)、抗逆性好、抗病能力強(qiáng)的新品種,可以為穿心蓮品質(zhì)改良和種質(zhì)創(chuàng)新提供新途徑。本項目采用染色體倍性育種技術(shù),培育穿心蓮單倍體植株,重點考察不同生長發(fā)育時期穿心蓮小花花藥小孢子的活力;供體植株生長狀況、小孢子發(fā)育時期、預(yù)處理、激素對穿心蓮單倍體植株誘導(dǎo)的影響;穿心蓮單倍體、二倍體植株、同源四倍體的染色體倍性及穿心蓮總內(nèi)酯含量檢測。本研究為基于染色體工程選育產(chǎn)量高、有效成份含量高、品質(zhì)優(yōu)良的穿心蓮新種質(zhì)提供技術(shù)支持,為穿心蓮種質(zhì)資源的可持續(xù)利用及產(chǎn)業(yè)化種植推廣提供理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。(1)對穿心蓮的花進(jìn)行解剖學(xué)研究,通過穿心蓮花序及小花形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察、體視鏡下解剖、顯微鑒別等方法對穿心蓮花的形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究。穿心蓮的花序為總狀花序,小花長度1.3~1.5cm,全花附腺毛和微毛;花萼5,披針形;唇形花冠,上唇瓣兩瓣合生1淺裂,白色;下唇瓣三瓣合生2深裂,有深紫色斑紋;雄蕊2,花藥連生,花絲有白色絨毛;雌蕊1,柱頭伸至兩花藥之間,子房上位,2心皮,2室,中軸胎座;花粉粒長橢圓形或圓球形,表面具淺紋,有縱溝,3個萌發(fā)孔;穿心蓮花藥壁由表皮、藥室內(nèi)壁和絨氈層組成;花粉小孢子有單核期,雙核期與成熟期,單核期的小孢子又分為單核居中期與單核靠邊期。上述鑒別特征可用于確定穿心蓮花粉發(fā)育時期與穿心蓮小花之間的對應(yīng)關(guān)系。(2)以穿心蓮花粉為實驗材料,明確穿心蓮小花供體生長階段、采集時間與穿心蓮花粉活力之間的關(guān)系,建立穿心蓮花粉體外萌發(fā)最適培養(yǎng)條件,比較I_2-KI染色法、TTC染色法染色效果。通過I_2-KI染色法、TTC染色法、離體萌發(fā)法測定不同時期和采集時間的穿心蓮花粉活力;采用離體培養(yǎng)法研究不同培養(yǎng)基組分和預(yù)處理對花粉管萌發(fā)的影響。以碘-碘化鉀染色法測定花粉活力,15:00采集的藥絲比為1:4的花粉染色率最高;用TTC染色法測定花粉活力,15:00采集的藥絲比為1:6的花粉染色率最高,TTC法測定的花粉活力趨勢與花粉管萌發(fā)法測定的花粉活力趨勢相同,均為花粉活力隨著藥絲比的減少而成增高趨勢。穿心蓮花粉離體萌發(fā)較為適宜的培養(yǎng)基組合為:10%蔗糖+0.3 g·L~(-1)氯化鈣+1 g·L~(-1)硼酸+15%PEG,萌發(fā)率為82.5%。預(yù)處理條件對穿心蓮花粉離體萌發(fā)有顯著影響,4℃冷處理24 h能顯著提高花粉萌發(fā)率(P0.05)。4℃冷處理48 h與30℃熱處理24 h的穿心蓮花粉管萌發(fā)率與對照組無顯著差異。但30℃熱處理48 h組可得出,隨著熱處理時間的增長,花粉管萌發(fā)率有下降趨勢。(3)以穿心蓮的小花為實驗材料,明確穿心蓮單倍體愈傷組織最優(yōu)的誘導(dǎo)條件和分化條件。在無菌條件下以穿心蓮花粉小孢子懸浮液和花藥為實驗材料。以MS為基本培養(yǎng)基花粉小孢子懸浮液與花藥均不能產(chǎn)生肉眼可見的愈傷組織。在以N6培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基的正交試驗中,愈傷組織的誘導(dǎo)率為12.96%。最優(yōu)水平組合為A2B1C2D3,即1.0 mg·L~(-1)PP333、1.0 mg·L~(-1)KT、0.5 mg·L~(-1)2,4-D、0.5 mg·L~(-1)NAA。在Nistch培養(yǎng)基上的最高誘導(dǎo)率20.34%高于在N6培養(yǎng)基上的最高誘導(dǎo)率12.96%。但是在Nistch培養(yǎng)基上接種的花藥誘導(dǎo)時間長,繼代培養(yǎng)的過程中極易褐化,多次轉(zhuǎn)瓶,添加活性炭均不能抑制褐化,不利于實驗結(jié)果的統(tǒng)計,不不適宜用來誘導(dǎo)穿心蓮單倍體。選擇生活狀態(tài)良好的深綠色愈傷組織,轉(zhuǎn)入以下培養(yǎng)基中:N6+2.0 mg·L~(-1)6-BA+0.5 mg·L~-11 NAA+50 mL·L~(-1)椰汁,培養(yǎng)30d,愈傷組織分化出胚根,形態(tài)學(xué)上端深綠色呈心形。(4)采用染色體制片法和流式細(xì)胞術(shù)法鑒定誘導(dǎo)得到的胚性愈傷組織的染色體倍性,并且與正常倍性的穿心蓮植株和實驗室誘導(dǎo)的同源四倍體植株對比。最佳的染色體制片方法為:在2000 mg·L~(-1)秋水仙素溶液中處理2 h,冰箱4℃暗處理,蒸餾水漂洗5次,每次5 min;將預(yù)處理好的根尖材料轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液[無水乙醇:冰醋酸(3:1)]中迅速殺死細(xì)胞,固定24小時以上,放置于4℃冰箱中進(jìn)行暗處理,蒸餾水漂洗5次,每次5 min;取固定好的根尖,轉(zhuǎn)入1 mol·L~(-1)鹽酸溶液中60℃恒溫水浴解離,解離20 min,蒸餾水漂洗5次,每次5min;解離好的材料放在載玻片上,用刀片切去伸長區(qū),只留下1~2 mm的分生組織,滴一滴改良石碳酸品紅染色液染色5 min后,用稀醋酸洗去多余的改良石炭酸品紅染色液,即可進(jìn)行壓片,顯微鏡檢,拍照記錄。穿心蓮單倍體愈傷組織染色體X=12、二倍體染色體2X=24、同源四倍體染色體4X=48,經(jīng)體外雄核發(fā)育的穿心蓮愈傷組織染色體為原二倍體植株的1/2,鑒定為穿心蓮單倍體愈傷組織,經(jīng)染色體加倍后的植株染色體數(shù)目為原二倍體植株的2倍,即為同源四倍體。(5)采用高效液色譜法測定不同倍性穿心蓮植株有效成分穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量,明確穿心蓮染色體不同倍性類型與藥材產(chǎn)量及穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量的相關(guān)性。穿心蓮單倍體胚性愈傷組織中心蓮內(nèi)酯含量(0.660 mg·g~(-1)二倍體和同源四倍體分別為8.836、7.299 mg·g~(-1),穿心蓮四倍體的脫水穿心蓮內(nèi)酯含量(2.893 mg·g~(-1))比二倍體(0.659 mg·g~(-1))高,是二倍體的439%,具有顯著性意義。脫水穿心蓮內(nèi)酯主要來源于穿心蓮植株的葉,穿心蓮單倍體愈傷組織還未能分化出葉片,未能積累脫水穿心蓮內(nèi)酯。此方法可用于分化后穿心蓮單倍體植株的品質(zhì)評價。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S567.219
【圖文】：

圖 1 穿心蓮的花序與小花g.1 The inflorescence and flowers of Andrographis paniculata（ Burm.f.）N由圖 1 可知，穿心蓮花序為總狀花序，花從近主莖段開始開放，小花盛花時1.5cm，全花附腺毛和微毛；5 花萼；唇形花冠，上唇瓣兩瓣合生 1 淺裂，瓣三瓣合生 2 深裂，有深紫色斑紋；雄蕊 2，雌蕊 1。穿心蓮花序與小花形

圖 2 體視鏡下穿心蓮花的結(jié)構(gòu)B 下唇瓣（內(nèi)側(cè)） C 下唇瓣（外側(cè)） D 上唇瓣 E 雄蕊 F 雌蕊 G 花藥包圍型雌蕊（H 花藥包圍型雌蕊（后面觀） I 子房 J 子房（縱剖） K 子房（橫切）he structure of the flowers of Andrographis paniculata（B. f.）Nees ustereoscope B Inferior labial flap（inside） C Inferior labial flap（outside D Ep

圖 3 顯微鏡下穿心蓮花藥橫切結(jié)構(gòu) 顯微鏡下穿心蓮花藥橫切結(jié)構(gòu)（×40） B 顯微鏡下穿心蓮花藥橫切結(jié)構(gòu)（×1001 藥隔維管束 2 花藥壁表皮 3 藥室內(nèi)壁 4 絨氈層 5 藥室 6 花粉細(xì)胞 The anther crosscutting structure of Andrographis paniculata（ Burm.fA（×40） B（×100）lar bundle 2 Cuticular layer 3 Endithecium 4 Taoetum 5 Anther cell grain圖 3 可知，通過對冷凍切片研究發(fā)現(xiàn)可見藥隔中的維管束，穿心蓮花藥子。穿心蓮花藥壁表皮細(xì)胞扁平，細(xì)胞壁壁薄，有腺毛；藥室內(nèi)壁細(xì)胞齊；絨氈層細(xì)胞是花藥壁最內(nèi)的一層，可見殘余的絨毛。兩個藥室遠(yuǎn)基粉小孢子的暴露。.1.3.2.2 穿心蓮花藥壁、柱頭與花粉粒顯微結(jié)構(gòu)花藥壁和花粉粒，置于載玻片上的水滴中，加蓋玻片做成玻片標(biāo)本（臨時水合氯醛試液處理后在顯微鏡下觀察、拍照、作好記錄，見圖 4。

【參考文獻(xiàn)】

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4 趙璐;胡日生;蔡長春;周真珍;劉志;賀利雄;;秋水仙素對煙草單倍體植株染色體加倍的影響[J];作物研究;2015年03期

5 張曉強(qiáng);楊陽;金j;周海辰;姜少俊;宋瑜;王曉娟;;植物體外雄核發(fā)育途徑及其影響因素[J];云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué));2015年02期

6 郭桂梅;何婷;高潤紅;徐紅衛(wèi);陳志偉;黃亦辰;楊沙沙;劉成洪;李穎波;陸瑞菊;黃劍華;;預(yù)處理和培養(yǎng)溫度對陸稻游離小孢子愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響[J];植物生理學(xué)報;2014年12期

7 符策強(qiáng);韓義勝;孟衛(wèi)東;岑新杰;;不同濃度秋水仙素溶液對誘導(dǎo)水稻染色體加倍的影響[J];農(nóng)業(yè)科技通訊;2013年08期

8 馮翠;曾愛松;嚴(yán)繼勇;宋立曉;高兵;侯喜林;;影響青花菜游離小孢子培養(yǎng)的因素[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2011年06期

9 楊期和;楊和生;李姣清;;植物自花授粉的類型及其適應(yīng)性進(jìn)化[J];嘉應(yīng)學(xué)院學(xué)報;2011年08期

10 陸瑞菊;陳志偉;何婷;王亦菲;杜志釗;高潤紅;鄒磊;黃劍華;陳佩度;;兩份大麥品種單倍體細(xì)胞與植株水平耐鹽性的關(guān)系[J];核農(nóng)學(xué)報;2011年02期

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2 王清;;利用秋水仙素結(jié)合組織培養(yǎng)對馬鈴薯雙單倍體染色體加倍的研究[A];中國馬鈴薯學(xué)術(shù)研討文集（1996）[C];1996年

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本文編號：2788976