【摘要】：目的:本文旨在通過對道地藥材霍山石斛多糖生物合成中的關(guān)鍵酶GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMPP)的研究,為霍山石斛多糖生物合成路徑解析提供一定基礎(chǔ)。方法:本研究以霍山石斛新鮮植株為原材料,比較優(yōu)化了霍山石斛總RNA提取的方法,利用瓊脂糖凝膠電泳、蛋白核酸微量定量儀及特異性PCR擴(kuò)增對不同方法提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測;通過Illumina平臺進(jìn)行霍山石斛的轉(zhuǎn)錄組測序,以了解其相關(guān)基因的表達(dá)情況,為尋找其體內(nèi)合成次生代謝產(chǎn)物的核酸序列提供參考;針對分析結(jié)果及資料收集,實驗課題選擇霍山石斛GDP-甘露糖焦磷酸化酶進(jìn)行基因克隆,設(shè)計特異性引物并選用Extaq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,隨后對目標(biāo)基因進(jìn)行電泳檢測;將DNA條帶從凝膠中切取下來并經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA凝膠回收試劑盒處理后,用pGM-T Fast克隆試劑盒進(jìn)行重組質(zhì)粒構(gòu)建,將包含目標(biāo)基因的載體以熱休克方法導(dǎo)入大腸桿菌DH5α中培養(yǎng),培養(yǎng)出的菌落經(jīng)PCR擴(kuò)增確認(rèn)后,在LB氨芐西林培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)菌群再次經(jīng)PCR擴(kuò)增確認(rèn)目標(biāo)基因后,用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,在確定質(zhì)粒濃度后對質(zhì)粒進(jìn)行測序,并對獲得的目標(biāo)基因cDNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析;使用pDONR 221作為入門克隆進(jìn)行BP反應(yīng),繼之以pDEST17作為表達(dá)載體進(jìn)行LR反應(yīng)來構(gòu)建重組蛋白表達(dá)載體;利用qPCR技術(shù)檢測霍山石斛中根、莖、葉、花不同組織部位中GMPP基因的表達(dá)情況。結(jié)果:RNA提取方法優(yōu)化研究結(jié)果表明MCHAN法提取的霍山石斛總RNA條帶清晰,無彌散現(xiàn)象、完整性好且無其它雜質(zhì)污染。轉(zhuǎn)錄組測序,構(gòu)建了17個cDNA文庫,初步明確了霍山石斛轉(zhuǎn)錄組概況,發(fā)現(xiàn)了7種可能參與霍山石斛多糖合成的關(guān)鍵酶基因,包括蔗糖酶、蔗糖合成酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、磷酸甘露糖異構(gòu)酶、磷酸甘露糖酶與GDP-甘露糖焦磷酸化酶,為霍山石斛相關(guān)基因的克隆及驗證功能提供生物信息學(xué)證據(jù)。霍山石斛GMPP基因克隆得到其cDNA序列全長1867bp,包含1245bp的開放閱讀框,編碼415個氨基酸;對序列分析表明霍山石斛GMPP序列與鐵皮石斛、黃花石斛序列有99%相似性;進(jìn)化樹分析結(jié)果表明霍山石斛與鐵皮石斛、黃花石斛等植物有較近的親緣關(guān)系;通過BP和LR反應(yīng)構(gòu)建了霍山石斛GMPP重組表達(dá)載體,為后續(xù)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)及重組蛋白功能驗證提供基礎(chǔ);qPCR對霍山石斛中根、莖、葉、花不同組織部位中GMPP基因的表達(dá)情況檢測結(jié)果表明GMPP基因在霍山石斛莖中表達(dá)量最高,其次是葉,然后是花,根中表達(dá)量最低,同時發(fā)現(xiàn)霍山石斛GMPP基因表達(dá)水平與其莖、葉、花、根中多糖含量呈高度相關(guān)性,這對研究霍山石斛多糖生物合成機(jī)理將起到積極的促進(jìn)作用。結(jié)論:通過對霍山石斛RNA提取方法的優(yōu)化研究得到一種簡便、經(jīng)濟(jì)、高效的霍山石斛總RNA的提取方法,即MCHAN方法。解決了霍山石斛RNA提取的問題,為于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序及分子克隆提供基礎(chǔ)。通過對野生與栽培霍山石斛植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,構(gòu)建了17個cDNA文庫,初步明確了霍山石斛轉(zhuǎn)錄組概況,為后續(xù)相關(guān)基因進(jìn)行克隆及功能驗證提供數(shù)據(jù)資料。對道地藥材霍山石斛多糖生物合成中的關(guān)鍵酶GDP-甘露糖焦磷酸化酶的克隆及重組表達(dá)載體的構(gòu)建進(jìn)行初步研究,成功獲得了霍山石斛GMPP體外表達(dá)載體,為下一步對重組蛋白功能活性驗證提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S567.239
【圖文】：

霍山石斛轉(zhuǎn)錄組及其 GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因初步研究.2 凝膠電泳檢測結(jié)果與分析Trizol、Kit、CHAN、MCHAN 法提取霍山石斛莖、葉、花的總 RNA 經(jīng) 1.0%的性瓊脂凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖 1。圖中可見 MCHAN 法提取霍山石斛莖、葉、8S、18S 和 5S 條帶清晰、亮度高、無明顯拖尾降解現(xiàn)象，表明 MCHAN 法提取NA具有較好的完整性。

圖 2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig 2 PCR amplification results、克隆、轉(zhuǎn)錄組等的研究常需要從組織、完整性好的 RNA[31-33]。然而，從富含的[34]，多糖的理化性質(zhì)與 RNA相似很NA 發(fā)生不可逆的結(jié)合[35]，這些物質(zhì)不�；羯绞写罅康亩嗵�、酚類、蛋取帶來很多不便。植物總 RNA 提取方A 的提取效果也不盡相同。實驗中嘗試果不佳且價格相對較高。因此，尋找適

圖 3 霍山石斛轉(zhuǎn)錄組堿基含量分布統(tǒng)計Tab 3 The transcription of D.huoshanense set of base content distribution statisticsina 測序及從頭組裝究選擇 Illumina HiSeq 4000 進(jìn)行測序，野生與栽培霍山石斛 6個采樣部本。對測序的原始輸出結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量修剪，將霍山石斛讀長中包含的量不達(dá)標(biāo)的堿基去以得到干凈讀長。使用干凈讀長進(jìn)行 Trinity 軟件的用 CD-HIT-EST 軟件去除冗余序列，最終剩余合格的 241242 條重疊群(分析。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基本參數(shù)見表 4。從頭組裝得到序列的長度與頻度（石斛轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物最長的重疊群為 59869 bp，最短序列長度為 200 bp，平p。

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本文編號：2788604