發(fā)布時間：2020-07-28 14:10

【摘要】：研究水稻穎花的育性機理對于水稻生產(chǎn)具有重要意義。本研究通過~(60)Co-γ誘變獲得了一個以中恢8015為背景的無花粉型雄性不育突變體baymax1(bm1)。應(yīng)用花藥半薄切片、透射電鏡和掃描電鏡等方法鑒定了其不育成因,并通過圖位克隆、互補和敲除驗證和TUNEL檢測等實驗研究了該雄性不育基因的功能。主要結(jié)果如下:1.通過表型觀察發(fā)現(xiàn)突變體bm1營養(yǎng)生長正常,單壓片鏡檢結(jié)果顯示其花藥內(nèi)無可見花粉。2.半薄切片和透射電鏡結(jié)果顯示,突變體bm1中絨氈層在花藥發(fā)育的第9時期不能向分泌型絨氈層轉(zhuǎn)化,第10時期其胞質(zhì)內(nèi)細胞器幾乎完全降解,不能合成烏氏體,小孢子不能合成花粉壁,并逐漸降解。3.掃描電鏡結(jié)果顯示,突變體bm1花藥壁外表面蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)異常,花藥壁內(nèi)表面和花粉壁表面無排列整齊的顆粒結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果表明突變體bm1的絨氈層發(fā)育與降解異常,不能合成烏氏體,使得小孢子后期發(fā)育營養(yǎng)供給不足,最終降解。4.BM1被精細定位于4號染色體上4MD-6與4MD-11之間17.9 kb內(nèi)�；蜃⑨屝畔⒎治龊蜏y序分析顯示突變體bm1在第4個ORF(LOC_Os04g39470)的第2個外顯子上有一個A→T的替換,導(dǎo)致其氨基酸從谷氨酸變成了纈氨酸�；パa驗證和敲除鑒定結(jié)果表明確實是BM1(即OsMYB103)的突變造成了突變體bm1的雄性不育。5.表達譜分析結(jié)果顯示,BM1 5?端啟動子啟動其在花藥中特異表達,從第5時期開始表達,在第6時期表達最強,在第10時期晚期仍有微弱表達。序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示BM1編碼一個R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子,其在多個物種中的同源基因都具有調(diào)控花藥發(fā)育的功能。轉(zhuǎn)錄激活活性分析結(jié)果顯示,BM1確實具有轉(zhuǎn)錄激活活性,其C末端的64個氨基酸是主要的激活域。6.TUNEL檢測和石蠟切片DAPI染色結(jié)果顯示,BM1與其擬南芥同源基因AtMYB103一樣,反向調(diào)控絨氈層的降解。但胼胝質(zhì)鑒定結(jié)果顯示,BM1并不像AtMYB103一樣調(diào)控小孢子生成過程中的胼胝質(zhì)合成與降解。這說明BM1的功能在進化過程既有一定的保守性,又存在一定的變異。7.綜合qRT-PCR結(jié)果和相關(guān)基因變異產(chǎn)生的表型缺陷分析,表明BM1可能位于MSP1和UDT1的下游,與GAMYB、TDR平行反向調(diào)控下游絨氈層降解相關(guān)基因的表達和協(xié)同調(diào)控花粉壁形成相關(guān)基因的表達。另一方面,本研究通過反向遺傳學(xué)方法獲得了結(jié)實率低的low seed setting rate1(lssr1)突變體株系,并對其結(jié)實率低的成因進行了分析。主要結(jié)果如下:1.LSSR1是一個花藥特異表達基因,主要在減數(shù)分裂前期至單細胞花粉期的小孢子生成期間表達。預(yù)測LSSR1編碼一個GH5類纖維素酶,具有12個活性位點,包括GH5蛋白特有的酸/堿中心和親核中心,其N端有一段信號肽。2.利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除LSSR1后獲得一系列結(jié)實率降低的lssr1突變體株系。共分離分析、遺傳學(xué)分析和多位點單獨敲除結(jié)果證實LSSR1突變確實是lssr1株系結(jié)實率降低的原因。3.lssr1株系其它性狀與野生型無顯著差異,其雌雄蕊形態(tài)及花粉I_2-KI染色也都正常�；ǚ酃荏w內(nèi)萌發(fā)實驗結(jié)果表明,受精異常是lssr1株系結(jié)實率低的主要原因。lssr1株系受精受阻可能主要由其花粉萌發(fā)異常、花粉管穿透失敗和生長停滯造成。這些結(jié)果表明LSSR1對于水稻正常受精及保障其正常結(jié)實是必不可少的。本研究中這兩個基因及其功能研究將有利于我們進一步理解水稻育性的分子機制,為保障和提高水稻產(chǎn)量及利用雜種優(yōu)勢奠定理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S511
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文位于藥室內(nèi)。正常的花粉呈黃色，碘染后變深藍色，掃描電鏡下呈圓球形，外壁不光滑、有小顆粒物（圖 1.1）�；ǚ郯l(fā)育分為 14 個時期（圖 1.2）。1-6 時期，雄蕊原基的 3 層細胞通過分裂和分化形成四層壁細胞包圍著小孢子母細胞的結(jié)構(gòu)這四層壁細胞由內(nèi)至外分別是絨氈層、中間層、內(nèi)皮層及外皮層。7-9 時期，小孢子母細胞通過減數(shù)分裂形成 4 個小孢子。10-12 時期，絨氈層和中間層降解，小孢子進行有絲分裂并積累營養(yǎng)物質(zhì)，形成成熟的三核花粉。13-14 時期，花粉粒進一步成熟，花粉囊開裂，花粉釋放和進行授精。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文玉米中，他們加入熒光標(biāo)記基因作為篩選標(biāo)記基因，以篩選不育系和轉(zhuǎn)基因保系，并命名為 SPT 技術(shù)（Brink et al 2012）。近幾年，鄧興旺等提出將該技術(shù)用于創(chuàng)制水稻智能不育系，其基本原理是將水稻育性恢復(fù)基因（MS）、花粉致死基因（ -淀粉酶基因，AA）和紅色熒光蛋白基因（RFP）構(gòu)建到同一載體上，再轉(zhuǎn)入隱性核不育系中獲得轉(zhuǎn)基因保持系（Chang et al 2016）。轉(zhuǎn)基因保持系產(chǎn)生兩種花粉，ms 型可育，（MS+AA+RFP）ms 型不育，因此只有 ms 型花粉能與其自身的卵細胞結(jié)合，自交產(chǎn)生 msms 型的不育系和（MS+AA+RFP）msms 的保持（圖 1.7）。這樣既可以保證轉(zhuǎn)基因花粉不會傳到其他植株上，又可以保留隱性雄性不育系，并將其用于雜交稻制種中。這種技術(shù)可以同時彌補“三系法”和“兩系法”的不足，具有廣闊的應(yīng)用前景。不過水稻 SPT 技術(shù)的研究剛剛起步，要廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中還需要一定時日，需要育種家們繼續(xù)努力。

可觀察到野生型花藥呈飽滿狀、色黃，而 bm1 花藥稍微細短一些，且顏色為白色或較透明（圖2.1e, f）。壓片鏡檢結(jié)果顯示野生型花藥中充滿飽滿的深藍色花粉，而突變體花藥中根本看不見花粉，只有棕色的花藥壁結(jié)構(gòu)（圖 2.1g-j）。再者，用野生型中恢 8015的花粉對 bm1 柱頭進行授粉，可正常結(jié)實。因此，bm1 突變體是一個農(nóng)藝性狀未受影響的無花粉型雄性不育突變體。2.2.2 突變體 bm1 花藥的表型變異部位與時期為了觀察突變體 bm1 花藥發(fā)育過程中出現(xiàn)缺陷的部位和時期，對不同時期的花藥進行了半薄切片觀察。結(jié)果顯示：在小孢子母細胞時期至減數(shù)分裂完成期（第 6-8時期），突變體花藥與野生型花藥之間都沒有明顯的差異，同樣具有外壁（Ep）、內(nèi)壁（En）、中間層（ML）和絨氈層（T），也都生成形態(tài)正常的小孢子母細胞（MMC）、減數(shù)分裂細胞（MC）、二分體（Dy）和四分體（Tds）（圖 2.2a-h）。在第 9 時期時，野生型絨氈層大幅度皺縮，細胞內(nèi)泡狀結(jié)構(gòu)被重吸收，而突變體絨氈層仍保持一定的液泡化（圖 2.2i, m）。第 10 時期時

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 鄧興旺;王海洋;唐曉艷;周君莉;陳浩東;何光明;陳良碧;許智宏;;雜交水稻育種將迎來新時代[J];中國科學(xué):生命科學(xué);2013年10期

2 朱駿;楊仲南;;花粉壁發(fā)育研究進展[J];自然雜志;2013年02期

3 方子君;石其龍;楊仲南;張森;;水稻OsMS2基因在花藥發(fā)育中的功能分析[J];植物學(xué)通報;2008年06期

4 譚周摗,李訓(xùn)貞,陳良碧,周廣洽,李貽耀,謝樹東;安農(nóng)S—1的生態(tài)適應(yīng)性研究初報[J];雜交水稻;1990年03期

5 石明松,鄧景揚;湖北光感核不育水稻的發(fā)現(xiàn)、鑒定及其利用途徑[J];遺傳學(xué)報;1986年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 劉群恩;水稻類病斑突變體lm-ZH基因的圖位克隆與功能分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 石晶;水稻脂肪�；�原酶OsMS2基因的克隆及其在花粉壁發(fā)育中功能研究[D];上海交通大學(xué);2007年

本文編號：2772991