【摘要】：葉酸是一種人體必需的維生素,參與人類生命代謝活動的很多過程。在許多不發(fā)達國家,人群葉酸的攝入主要是從主糧作物中獲得。然而,主糧作物中的葉酸含量普遍偏低,由此使得葉酸缺乏成為一個全世界范圍的營養(yǎng)健康問題。玉米是世界上總產(chǎn)量最高的糧食作物之一,全球范圍內(nèi)超過3億的人口以玉米為主糧。通過遺傳學(xué)手段發(fā)掘玉米籽粒中葉酸變異的遺傳基礎(chǔ),可以改善玉米籽粒中的葉酸水平,克服葉酸缺乏營養(yǎng)健康問題。本研究通過全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法,發(fā)現(xiàn)了玉米籽粒中與葉酸主要形式5-F-THF含量變異顯著相關(guān)的新基因ZmGFT1。在此基礎(chǔ)上,利用候選基因關(guān)聯(lián)分析、連鎖分析、表達分析、單倍型分析和進化分析鑒定了該基因內(nèi)潛在的功能等位變異,并通過轉(zhuǎn)基因驗證了該基因的功能。這些發(fā)現(xiàn)為玉米葉酸代謝調(diào)控的研究奠定了新的遺傳學(xué)基礎(chǔ),也為通過分子設(shè)計提高玉米及其他作物的葉酸營養(yǎng)品質(zhì)提供了新思路。本研究取得的主要研究結(jié)果如下:1、通過對關(guān)聯(lián)群體中的531份玉米自交系在三個環(huán)境下收獲的成熟籽粒進行葉酸分析發(fā)現(xiàn),5-F-THF是玉米成熟籽粒中存在的主要葉酸形式,在玉米籽粒中存在豐富的遺傳變異。對三個環(huán)境下表型數(shù)據(jù)進行整合,獲得的BLUP數(shù)據(jù)顯示,5-F-THF的含量從0.58到8.18 nmol/g DW,均值為1.66 nmol/g DW。方差分析顯示5-F-THF的表型變異在基因型間達到了極顯著水平。對三個環(huán)境下的5-F-THF含量進行遺傳力分析,發(fā)現(xiàn)其遺傳力達到了0.79。這說明5-F-THF的表型變異主要是由遺傳因素控制的,可以通過遺傳定位手段鑒定出控制該表型變異的遺傳因素。2、利用玉米基因組中已經(jīng)獲得的558529個SNPs作為基因型,對5-F-THF含量進行全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)了36個與5-F-THF含量顯著關(guān)聯(lián)的位點,這36個位點分布在玉米5條染色體的9個基因上。其中,8個位點定位到第五條染色體一個潛在的葉酸代謝相關(guān)基因谷氨酸亞胺甲基轉(zhuǎn)移酶I(Glutamate formiminotransferase I,GFT1)上,基因編號GRMZM2G124863。該基因內(nèi)存在兩個處于完全連鎖不平衡狀態(tài)的位點Chr5.s_19676906和Chr5.s_19676907,與5-F-THF含量關(guān)聯(lián)最顯著,它們的P值均達到了1.46×10~(-21)。這兩個位點的共同變異導(dǎo)致該基因中編碼的氨基酸發(fā)生天冬酰胺和甘氨酸的轉(zhuǎn)變,這種變異可以解釋5-F-THF含量變異的27.6%。3、對155個自交系材料的關(guān)聯(lián)群體中GFT1基因進行擴增重測序分析,候選基因關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示有80個多態(tài)性位點與5-F-THF含量顯著關(guān)聯(lián)。在80個顯著關(guān)聯(lián)位點中,其中24個位于5’UTR,8個位于第二個外顯子,48個位于內(nèi)含子中。再次發(fā)現(xiàn)了全基因組關(guān)聯(lián)分析中找到的顯著關(guān)聯(lián)等位變異Chr5.s_19676906和Chr5.s_19676907。還發(fā)現(xiàn)了4個位于該基因5’UTR顯著關(guān)聯(lián)的InDel位點:S422、S637、S649和S696。通過表達分析和5-F-THF含量分析表明這4個InDel位點也是潛在的影響5-F-THF含量的功能位點。4、授粉后15天種子中基因表達量作為表型,558529個SNPs作為基因型,進行全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示在第五條染色體ZmGFT1位置發(fā)現(xiàn)了一個表達QTL(P=7.15×10~(-13)),這表明ZmGFT1中可能存在順式調(diào)控機制來調(diào)節(jié)該基因的表達。利用玉米自交系GEMS31和Dan3130構(gòu)建的F_(2:3)分離群體定位到一個與5-F-THF含量相關(guān)的QTL,與ZmGFT1共定位,這個QTL可以解釋5-F-THF含量變異的14.9%。5、對獲得的6個顯著多態(tài)性位點進行單倍型分析發(fā)現(xiàn),Hap1、Hap4、Hap7在Chr5.s_19676906的基因型均為G,三種單倍型的5-F-THF含量顯著高于其他單倍型。Hap1綜合了所有的優(yōu)良等位變異,葉酸含量最高,達到了2.12 nmol/g DW。9種單倍型可以解釋5-F-THF表型變異的40%。轉(zhuǎn)基因擬南芥種子結(jié)果顯示,Qi319-GFT1的過表達擬南芥種子5-F-THF的含量比col野生型顯著提高,B73-GFT1過表達轉(zhuǎn)基因種子5-F-THF與col野生型沒有明顯差異。Qi319-GFT1和B73-GFT1過表達轉(zhuǎn)基因擬南芥種子5-M-THF含量比col野生型都顯著下降。轉(zhuǎn)基因玉米葉片中結(jié)果顯示,B73-GFT1過表達玉米葉片中5-F-THF含量比對照顯著提高,而RNAi玉米葉片中5-F-THF含量比對照顯著降低。利用Swiss-Model同源建模預(yù)測的ZmGFT1的三維蛋白結(jié)構(gòu)表明,ZmGFT1的結(jié)合口袋位于該蛋白的兩個原聚體的界面上,而多態(tài)性位點Chr5.s_19676907引起變化的氨基酸也位于兩個原聚體的界面上,可能會造成該蛋白結(jié)合口袋的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,影響蛋白的功能。對ZmGFT1進行亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn),ZmGFT1與細胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有共定位,與線粒體、葉綠體、過氧化物酶體和高爾基體沒有共定位。在利用玉米的表達數(shù)據(jù)構(gòu)建的共表達網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn),與擬南芥直系同源的葉酸代謝相關(guān)基因中,只有ZmMTHFR與ZmGFT1有共表達關(guān)系。共表達網(wǎng)絡(luò)中還發(fā)現(xiàn)了17個新基因與ZmGFT1有共表達,其中13個基因可能與葉酸相關(guān)的生物過程有關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S513
【圖文】：

獻綜述葉酸背景介紹 葉酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)酸，也稱為維生素 B9，是一種水溶性 B 族維生素，是葉酸及其衍生物的由三部分組成：對氨基苯甲酸（p-ABA）蝶呤、和不同谷氨酸殘基組成不同氧化水平的一碳單位（甲基、甲酰基、亞甲基、次甲基、亞胺甲過葉酸代謝相關(guān)酶的作用連接到蝶呤的 N5 或 p-ABA 的 N10 位置，形平的葉酸衍生物，在不同的代謝途徑中發(fā)揮不同的功能（圖 1.1）。自很不穩(wěn)定，對光、氧化、熱和酸都很敏感，極易發(fā)生分解，造成蝶呤和生斷裂 (Gregory 1989)。而在生物體內(nèi)，葉酸通過形成抗氧化復(fù)合物某些葉酸結(jié)合蛋白結(jié)合增加其穩(wěn)定性 (Scott et al 2000)。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆博士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文（HMDHP）進入線粒體。進入線粒體的 HMDHP 經(jīng)過二氫蝶呤焦磷酸激酶催成 6-羥甲基二氫蝶呤焦磷酸（HMDHP-P2）。p-ABA 的合成是在葉綠體中以分支底物開始的，分支酸依次經(jīng)過分支酸合成酶(ADCS)和分支酸裂解酶(ADCL)催成 p-ABA 進入線粒體。HMDHP-P2和 p-ABA 在二氫蝶酸合酶(DHPS)的作用下二氫蝶酸（DHP）。DHP 與谷氨酸(Glu)在線粒體內(nèi)的二氫葉酸合成酶(DHFS)的下生成二氫葉酸(DHF)，DHF 在二氫葉酸還原酶(DHFR)作用下生成四氫葉酸（T圖 1.2）。

圖 1.3 基于葉酸缺乏的 NTDs 患病率高危區(qū)域（每萬個新生兒患 NTDs 數(shù)）(Blancquaert et a2014)Figure 1.3 Risk regions of folate deficiency based on NTD prevalence (number of NTDs per10000 births) (Blancquaert et al 2014)1.1.8 葉酸的補充現(xiàn)在，克服葉酸攝入不足主要是通過在食物中強制添加人工合成的葉酸或者通過補充葉酸片來滿足人們對葉酸的需求 (Botto et al 2005; Bouis 2002)。葉酸被人體吸收后，先被還原成有活性的 DHF 和 THF，然后再轉(zhuǎn)變成其他可利用葉酸形式參與各種反應(yīng) (Mcguire and Coward 1984)。另外，人類還可以從一些葉酸含量較高的食物中獲取葉酸，如雞蛋、酵母、動物肝臟和綠葉蔬菜等。但是有報道指出攝入人工合成葉酸過多會給人類健康帶來一些不好的影響 (Blancquaert et al 2014; Marean eal 2011; Mills et al 2003; Ray et al 2003; Takimoto et al 2011)。并且這些方法的成本都是很高的，對于生活在貧困地區(qū)的人口難以實現(xiàn)。普通成年人每天建議的葉酸攝入

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 姜凌;張春義;;作物葉酸生物強化[J];生命科學(xué);2015年08期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 孟紅巖;擬南芥質(zhì)體定位的葉酰聚谷氨酸合成酶AtDFB生物學(xué)功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

2 王明;玉米抗絲黑穗病的全基因組關(guān)聯(lián)分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 金亮;水稻關(guān)聯(lián)定位群體的構(gòu)建及若干品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析[D];浙江大學(xué);2009年

本文編號：2771353