【摘要】：廣藿香(Pogostemon cablin(Blanco)Benth)是一種重要的嶺南中藥材和工業(yè)作物,富含廣藿香揮發(fā)油,包含多達24種倍半萜特異化合物,其中含量最高的是具有顯著生物活性的廣藿香醇。廣藿香醇屬于三環(huán)倍半萜化合物,其生物合成來源于經典的MVA途徑和MEP途徑。為解析廣藿香倍半萜生物合成途徑,我們利用綜合分析的方法對基因的序列結構、同源性、保守結構域特性、亞細胞定位、系統發(fā)育、表達模式和功能表征進行分析。研究了PatFPPS的表達模式、亞細胞定位和功能,并對PatFPPS基因同源表達和異源表達進行研究,以期為廣藿香醇的代謝工程提供更多可能的調控靶點。本論文主要研究結果包括以下幾點:1.基于轉錄組對廣藿香倍半萜合成途徑關鍵酶進行分析首次在廣藿香轉錄組中鑒別出78條與萜類物質合成相關的基因,其中參與到MVA、MEP和萜類物質下游途徑的基因數量分別為28條、38條和12條。分析了這些基因在廣藿香花、莖和葉片中的轉錄水平,發(fā)現這些基因在不同組織中均有表達,其中MVA途徑關鍵酶主要在花中的表達,MEP關鍵酶基因在葉片中的表達水平最高,下游關鍵酶基因在花和葉片中的表達水平相對較高�；谵D錄組測序結果,分析了這些基因的基本序列結構,發(fā)現幾乎所有的基因都具有相應的結構域,利于后續(xù)對萜類合成途徑關鍵酶進一步研究。2.廣藿香倍半萜合成途徑關鍵酶的克隆與表征基于轉錄組分析,篩選表達量相對較高且具有完整的CDS的基因進行克隆,得到 MVA 途徑酶基因(PatDXS、PatDXR、PatMCT、tCMK、PatMDS、PatHDS和PatHDR)、MEP 途徑酶基因(PatAACT、PatHMGS、PatHMGR、PatMVK、PatPMK和PatMVD)和下游途徑關鍵酶(PatIPPI和PatFPPS)。利用生物信息學分析這些基因的序列結構、同源性、保守域、亞細胞定位和系統發(fā)育。利用大腸桿菌顏色互補實驗驗證了 MEP通路蛋白的功能活性。熒光定量PCR分析表明,MVA途徑基因(PatAACT、PatHMGR、PatMVD和PatFPPS)參與由MeJA介導廣藿香醇的生物合成。這些結果為利用萜類基因工程提高廣藿香醇含量提供了有益的信息。3.PatFPPS的分子鑒定與亞細胞定位研究本論文首次從廣藿香中分離出PatFPPS基因,cDNA全長為1050 bp,具有典型的保守結構域,與其他植物物種的FPPS具有高度同源性。通過qRT-PCR對PatFPPS的表達模式進行分析,發(fā)現PatFPPS具有組織特異性,并且受到MeJA、ABA、ETH和SA植物激素的誘導。將PatFPPS分別與GFP的N端和C端融合進行定位實驗,結果顯示PatFPPS定位于細胞質,而不是過氧化物酶體,符合生物信息學預測。4.廣藿香PatFPPS調控萜烯和廣藿香醇的生物合成在FPS缺陷菌株中PatFPPS的功能互補實驗,證明PatFPPS具有生物活性,介導法呢基二磷酸的生物合成。構建植物瞬時過表達載體研究PatFPPS在廣藿香植株中的功能。通過GUS組織化學染色證實了表達載體構建成功并且能在廣藿香葉片中表達。通過GC-MS分析發(fā)現過表達株系中廣藿香醇含量高達2.16 mg/g,比對照植株增加了 0.5倍左右,說明PatFPPS可以催化代謝流往廣藿香醇生物合成的方向流動,促進廣藿香醇的積累。為了深入研究PatFPPS在萜類代謝中的作用以及對萜烯產物的影響,我們獲得了 26株陽性轉PatFPPS基因煙草。通過普通PCR擴增與qRT-PCR證實PatFPPS基因在轉基因植物的葉片中表達,并且qRT-PCR結果顯示PatFPPS表達水平比對照比高5-15倍。ELISA實驗顯示,轉基因煙草中FPPS酶活性顯著上調。揮發(fā)性萜類測定結果表明轉基因煙草中的豆甾醇、植物醇和新植物二烯含量顯著升高,這與在PatFPPS過表達植株中觀察到的基因表達和FPPS酶活性變化一致,說明PatFPPS是廣藿香醇合成途徑關鍵酶并且促進萜烯類化合物的生物合成。5.PatFPPS啟動子分離與互作蛋白的篩選利用FPNI-PCR分離PatFPPS啟動子,得到一段長度為724 bp的啟動子,利用生物信息學軟件分析,發(fā)現該啟動子具有真核生物啟動子必需的核心元件(TATA-box)外,還含有ERE(乙烯響應元件)、ABRE(脫落酸響應元件)、光響應元件、BOX-W1(真菌脅迫)、AT-rich element(AT-rich的DNA與蛋白結合位點)等順式作用元件。通過酵母單雜交實驗篩選到若干可能參與PatFPPS啟動子互作并調控其表達的基因。
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S567.239
【圖文】：

為了鑒定在廣藿香中涉及倍半萜生物合成的基因及其時空表達，基于我們的轉錄逡逑組數據研究了葉、莖和花中７４種新的倍半萜生物合成相關基因的轉錄特征和表達豐逡逑度（圖１－１）。這些基因屬于１５個基因家族，它們編碼ＭＶＡ途徑和ＭＥＰ途徑中參與逡逑基本異戊二烯前體ＩＰＰ及其異構體ＤＭＡＰＰ生物合成的所有酶，以及法尼基焦磷酸合逡逑酶。這７４個基因的序列長度范圍為８０４至３３４３邋ｂｐ，平均ｍＲＮＡ長度為１９７２ｂｐ。大逡逑多數轉錄本都被Ｎｒ、ＫＥＧＧ、ＧＯ和ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ數據庫充分注釋。我們發(fā)現ＭＶＡ途徑逡逑關鍵酶基因在花中表現出最高的表達水平，而ＭＥＰ途徑關鍵酶基因在葉中表現出最逡逑１２逡逑

邐廣州中醫(yī)藥大學２０１９屆碩士學位論文邐逡逑轉錄組中鑒定了八個ＡＡＣＴ基因（Ｐｆｌ／Ａ４ＣＴｌ－Ｐｏ＾Ｌ４Ｃ：Ｔ８）（表Ｓ２）�；虮磉_譜顯示逡逑兄４ＣＴ１－／＾／義４Ｃｒ８在所有組織中都有表達，并且主要在葉中高度表達（圖１－１）。逡逑／＾ＭｊＣ；Ｔ６在葉片中的表達水平最低，可能是因為它缺乏完整的保守的硫解酶結構域逡逑（圖１－２）。化／NB４ＣＴ１和具有非常高的序列相似性并且顯示出相似的表達逡逑水平，表明它們可能是廣藿香中的重復基因。逡逑ＡＡ（ＴＩ邋？—？？？？■．■■■■■■邋＇—．ＰＭＫ１邐ｍｍ＊邐＊＊＊邐ＨＩＩＳＩ邐＿閨丨＊，伽＊ｌｕ＿丨■…＂}0曬？■剛命＿｜＿曬＿邋．逡逑

ＸＲ催化ＤＸＰ向ＭＥＰ的分子內重排和還原。在廣蕾香轉錄組數據中僅發(fā)現一逡逑Ｒ基因（八ｙ／ＤＡＴ？），其推測的ＰａｔＤＸＲ蛋白含有兩個ＮＡＤＰＨ結合基序和ＤＸＲ逡逑活性位點（圖１－２）。在這項研宄中，ＰａｔＤＸＲ表現出組織差異性表達，其在花逡逑量最高，其次是葉和莖（圖１－１）。逡逑后在ＭＣＴ催化的ＣＴＰ依賴性反應中將ＭＥＰ轉化為４－（胞苷５＇－二淲酸）－２－Ｃ－逡逑－赤蘚糖醇（ＭＥＰ）。在我們的ｃＤＮＡ文庫中篩選了兩個基因，并且衍逡逑白質含有保守的ＩｓｐＤ基序，并且構建系統進化樹發(fā)現這２個基因與其他植物逡逑Ｔ具有高度同源性。ＰＭＭＣＴ１和主要在葉片中表達，在花和莖中表達逡逑低（圖１－１）。在ＭＥＰ途徑的接下來三個反應中，ＣＭＥ的Ｃ２位置的羥基進一逡逑ＭＫ磷酸化，并且生成的產物２－磷酸－４－（胞苷５’－二磷酸）２－Ｃ－甲基－Ｄ－赤蘚糖逡逑ＭＥ）隨后被轉化為２－Ｃ－甲基－Ｄｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ２，４－環(huán)二磷酸（ＣＭＥＣ），然后被ＭＤＳ逡逑然后用ＨＤＳ將ＣＭＥＣ還原為ＨＭＢＯ�；谵D錄組數據，本研究鑒定了邋１個逡逑Ｓ基因、４個尸ａ／ＭＤＳ■基因和４個Ｐａ／Ｚ／ＡＳ基因。和主要在葉逡逑達。其中和／的轉錄水平與ＭＥＰ途徑中的其他基因家族相似逡逑

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本文編號：2769087