【摘要】：玉米(Zea mays)是生產(chǎn)食品、動物飼料、生物燃料和化工產(chǎn)品的原料,是世界上產(chǎn)量最高、最重要的作物之一,而干旱是影響作物產(chǎn)量和生長的主要非生物脅迫。Full-length cDNA Over-eXpressing gene hunting system(FOX)2006年被提出,其原理是利用一定數(shù)量的cDNA在生物中異位高效表達,從而構(gòu)建一個功能獲得型文庫批量鑒定基因的功能。細胞對滲透脅迫的應(yīng)答在真核生物中是保守的,因此,篩選表達異源cDNA的酵母文庫是研究干旱脅迫相關(guān)基因的高效方法。本文構(gòu)建了一個玉米干旱脅迫相關(guān)cDNA酵母文庫(FOX),通過利用山梨醇模擬干旱獲得了候選基因,并鑒定了玉米中CBS結(jié)構(gòu)域的基因家族。主要研究結(jié)果如下:(1)以陜A、B群篩選出的抗旱自交系KA105為材料,通過對RNA提取、cDNA雙鏈合成循環(huán)數(shù)、cDNA長度分級及載體線性化等步驟進行優(yōu)化構(gòu)建了酵母文庫。結(jié)果顯示,構(gòu)建的原核文庫的庫容達到了6.5×10~6 cfu,絕大多數(shù)插入基因的片段大小為0.75 kb~2.00 kb,平均長度大于1.00 kb,重組率95%,真核文庫的庫容達到了2.8×10~6 cfu。這說明構(gòu)建了高質(zhì)量的FOX文庫。(2)篩選整個玉米抗旱FOX酵母文庫,分析候選基因并利用玉米KA105自交系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行表達特征分析。結(jié)果顯示,在2 mol/L山梨醇脅迫下極少的野生型酵母可以存活,因此以2 mol/L山梨醇從整個文庫中篩選出38個非冗余的基因,這些基因涉及信號傳導(dǎo)(9個)、轉(zhuǎn)錄因子(5個)、抗氧化劑(2個)、代謝(5個)、熱激蛋白/分子伴侶(2個)、細胞結(jié)構(gòu)(4個)、激素響應(yīng)(2個)、氧化還原穩(wěn)態(tài)(1個)、物質(zhì)運輸(1個)、假定蛋白(5個)還有兩個基因通過多種途徑參與抗旱。隨后,對得到的38個候選酵母再次進行滲透脅迫。大多數(shù)基因可以響應(yīng)干旱脅迫,有些基因在特定組織(葉或根)上調(diào)表達,編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子和ABA響應(yīng)蛋白的基因可以在整株水平強烈的響應(yīng)干旱。5個編碼未知蛋白基因中的4個可以響應(yīng)干旱脅迫,這說明可能有未知功能的新途徑介導(dǎo)了玉米抗旱。(3)篩選的38個基因中有一個包含CBS結(jié)構(gòu)域,因此,分析了玉米CBS基因家族,并利用B73自交系在正常和干旱脅迫下的表達譜進行表達特征分析。結(jié)果顯示,鑒定了33個玉米CBS家族基因,構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹,結(jié)合ZmCBS家族基因的保守結(jié)構(gòu)域和保守基序?qū)⑵浞譃?0個亞組。正常條件下,同一亞組成員的表達既有保守性同時也出現(xiàn)了變異。干旱脅迫下,多個基因在特定組織上調(diào)表達,ZmCBS17在整個植株水平都可以響應(yīng)干旱脅迫。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S513
【圖文】：

圖 2-1 3 種 RNA 提取方法電泳圖 A：TRNzol 法；B：TaKaRa 試劑盒法；C：QIAGEN 試劑盒法；D：7 號 37 ℃ 溫育 編號代表重復(fù)Fig. 2-1 Three kinds of total RNAextraction methods revealed by agarose gel electrophoresiA: TRNzol method; B: TaKaRa Kit method; C: QIAGEN Kit method; D: Number 7 37 ℃ inc2 h; Numbers for replication.2 cDNA 雙鏈的合成及分級提取完 RNA 首先進行反轉(zhuǎn)錄將 mRNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 單鏈，mRNA 僅占總%~5%，因此，根據(jù)說明書的建議添加的 RNA 模板量為 1 μg。合成單鏈后添加 解 mRNA，更有利于長距離 PCR 合成 cDNA 雙鏈。在配置長距離 PCR 反應(yīng)先將所有體系在一個 500 μL 離心管中充分混勻，而后每管 100 μL 分裝兩管，保證兩管的 PCR 反應(yīng)保持同步。在cDNA單鏈合成后，以不同PCR循環(huán)數(shù)合成雙鏈cDNA，兩管各100 μL反應(yīng)一反應(yīng) 6 個循環(huán)，而后 4 ℃保存 170 μLPCR 反應(yīng)液，剩下的 30 μL 用來探索數(shù)。每循環(huán) 2 次取出 6 μL，最終得到了 8、10、12 和 14 循環(huán) PCR 產(chǎn)物。從

圖 2-2 不同 PCR 循環(huán)數(shù)合成第二鏈 cDNA注 M：D2000 DNAmarker；1：8 循環(huán)；2：10 循環(huán)；3：12 循環(huán)；4：14 循環(huán)ig. 2-2 Synthesized second strand cDNAs with different cycles of PCR amplificatte M: D2000 DNAmarker; 1 for 8 cycle; 2 for 10 cycle; 3 for 12 cycle; 4 for 14 c選擇了最佳循環(huán)數(shù)，短片段還是會大量擴增，為了去除較短的片段的 CHROMA SPINTM +TE-1000 分級柱，將雙鏈 cDNA 依據(jù)片段長分級柱可以處理 85 μL 的 PCR 產(chǎn)物，產(chǎn)物和洗脫液可以形成 16 個液 25~40 μL，從每個液滴取 3 μL 用瓊脂糖凝膠電泳檢測。對于樣品整個凝膠圖呈現(xiàn)階梯狀，1~5 孔沒有出現(xiàn)條帶，第 6 孔開始有條帶且有明顯的產(chǎn)物且長度較長大于 0.50 kb，隨著孔數(shù)的增加，除了有較開始出現(xiàn)，10 孔為分界線長片段逐漸消失，短片段大量出現(xiàn)，14~1。因此對于樣品 1 收集了編號 6~9 液滴。

圖 2-2 不同 PCR 循環(huán)數(shù)合成第二鏈 cDNA注 M：D2000 DNAmarker；1：8 循環(huán)；2：10 循環(huán)；3：12 循環(huán)；4：14 循環(huán)Fig. 2-2 Synthesized second strand cDNAs with different cycles of PCR amplificationNote M: D2000 DNAmarker; 1 for 8 cycle; 2 for 10 cycle; 3 for 12 cycle; 4 for 14 cycle即使選擇了最佳循環(huán)數(shù)，短片段還是會大量擴增，為了去除較短的片段，使盒推薦的 CHROMA SPINTM +TE-1000 分級柱，將雙鏈 cDNA 依據(jù)片段長度進。一個分級柱可以處理 85 μL 的 PCR 產(chǎn)物，產(chǎn)物和洗脫液可以形成 16 個液滴，個液滴 25~40 μL，從每個液滴取 3 μL 用瓊脂糖凝膠電泳檢測。對于樣品 1 從圖以看出整個凝膠圖呈現(xiàn)階梯狀，1~5 孔沒有出現(xiàn)條帶，第 6 孔開始有條帶且靠近，7 孔有明顯的產(chǎn)物且長度較長大于 0.50 kb，隨著孔數(shù)的增加，除了有較長的片段也開始出現(xiàn)，10 孔為分界線長片段逐漸消失，短片段大量出現(xiàn)，14~16 孔 cD全消失。因此對于樣品 1 收集了編號 6~9 液滴。

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本文編號：2766360