發(fā)布時(shí)間：2020-07-22 12:12

【摘要】：電壓依賴(lài)性陰離子通道(voltage-dependent anion channels,VDACs)是廣泛存在于線(xiàn)粒體上的一種孔道蛋白,可以控制代謝產(chǎn)物、無(wú)機(jī)鹽的運(yùn)輸,維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),并與細(xì)胞凋亡有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期鑒定出了8種水稻VDAC蛋白,本實(shí)驗(yàn)主要圍繞OsVDAC4和OsVDAC5來(lái)進(jìn)行,主要取得以下2個(gè)方面結(jié)果:1.將OsVDAC4全長(zhǎng)序列連接兩個(gè)誘餌蛋白載體pBT3-N和pBT3-SUC,膜蛋白酵母雙雜交結(jié)果表明pBT3-SUC-OsVDAC4可用于文庫(kù)篩選。從YTB幼穗cDNA文庫(kù)中篩選出4個(gè)可能與OsVDAC4互作的蛋白,進(jìn)一步點(diǎn)對(duì)點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)證明只有LOC_Os02g06640.1和LOC_Os06g51220.2與OsVDAC4互作,暫命名為OsV4IP1和OsV4IP2。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)OsV4IP1蛋白有14次或是22次跨膜,或是沒(méi)有跨膜。OsV4IP2蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)。OsV4IP1和OsV4IP2都定位在核上。2.對(duì)OsVDAC5的ATG上游4500 bp序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析后,將其分為4個(gè)5'部分缺失片段pB、pC、pD和pE。將4個(gè)片段分別連接雙元表達(dá)載體DX2181,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。目前只得到了pC、pD和pE表達(dá)GFP的陽(yáng)性植株。對(duì)部分植株進(jìn)行熒光觀察結(jié)果表明pC、pD和pE在根的厚壁組織、內(nèi)皮層、中柱表達(dá),pC和pD在葉的表皮和中柱,葉鞘的韌皮部、葉舌、葉節(jié),穎殼,花蕊表達(dá)。在根的皮層薄壁組織,葉肉,葉鞘內(nèi)部都不表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：中南民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2;S511
【圖文】：

圖 1.2 VDAC 信號(hào)通路圖(DeHart et al., 2018a)Fig 1.2 Graphical of VDAC signal pathway(DeHart et al., 2018a)DACs 的其他功能科植物中，有研究表明膜脂調(diào)節(jié) VDAC 的功能。磷脂是 PcV節(jié)因子，并且鹽濃度也對(duì)此有影響(Mlayeh et al., 2017)。釀蛋白 Por1 和 Por2 正向調(diào)節(jié) AMPK/Snf1 催化激活，且 Ponf1 核定位的過(guò)程中也起到重要作用(Shevade et al., 2018)。分子與 yVDAC1 相比，yVDAC2 具有不同數(shù)量的鉀離子和氯離子ni et al., 2018)。以粗糙脈孢菌作為研究對(duì)象，將 VDAC 的 N 末2-12porin 被組裝到外膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型相比蛋白質(zhì)的水平電子傳遞鏈缺陷、交替氧化酶表達(dá)以及生長(zhǎng)速率下降(S研究表明在小鼠中，敲除 VDAC3 會(huì)導(dǎo)致活性氧(reactive oxyg加，改變腎臟鈉的運(yùn)輸，導(dǎo)致高血壓(Zou et al., 2018)。神經(jīng)

中南民族大學(xué)碩士學(xué)位論文嘗試構(gòu)建部分 OsVDACs 的 RNAi 植株，并取得初步成功（江晨，2011）。之后對(duì) OsVDACs 的原核、真核表達(dá)進(jìn)行了研究（熊杰，2012；劉洋，2014）。并對(duì)OsVDACs 進(jìn)行了亞細(xì)胞定位（鐘英健，2015）。通過(guò)膜蛋白酵母雙雜交技術(shù)從YTB 幼穗 cDNA 文庫(kù)中篩選到了 OsVDAC3 的 3 個(gè)互作蛋白，成功得到了OsVDAC3 超表達(dá)植株（胡穎，2015）。并進(jìn)一步驗(yàn)證了 OsVDAC3 與其互作蛋白間的互作（程英，2017）。成功得到 OsVDAC5 的 RNAi 轉(zhuǎn)基因植株，并篩選得到了 7 個(gè)與 OsVDAC5(1-75aa)互作的蛋白（諶鑫，2015），將其命名為OsV5IP1-7，為了探索 OsVDAC5(1-75aa)與 OsV5IP1-7 是否真正互作，還進(jìn)行了酵母雙雜、pull down、BiFC 實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示它們之間發(fā)生了互作（李雙紅，2016）。OsVDAC5 互作蛋白的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)顯示 OsV5IP2-5 定位于線(xiàn)粒體，OsV5IP1、6、7 定位于細(xì)胞質(zhì)（吝婷婷，2017）。

要檢測(cè)誘餌蛋白載體的自激活活性。這種酵母雙雜交互作。分離-泛素系統(tǒng)(split-ubiquitin system)是利用泛泛素蛋白的第 34-76 氨基酸）和 NubI（包含泛素蛋白征進(jìn)行的。Cub 與 NubI 在自然條件下可以形成完整 突變成 NubG 之后，Cub 與 NubG 在自然條件下難以形白酵母雙雜交就是基于泛素的這個(gè)特性來(lái)篩選互作蛋 Cub，待篩選的蛋白連接泛素的 NubG，當(dāng)兩者發(fā)生，形成完整的泛素蛋白，完整的泛素蛋白被泛素特異性A-VP16 從 NubG-Cub-LexA-VP16 復(fù)合體上切下，LexDNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合到與之對(duì)應(yīng)的順式作用元件上，域，LexA-VP16 復(fù)合體啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，例如 E2、HIS3 報(bào)告基因的表達(dá)可以使酵母在 SD-4 培養(yǎng)基苷酶，用 X-gal 進(jìn)行顯色反應(yīng)可以顯出藍(lán)色。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王宏;李剛波;張大勇;藺經(jīng);盛寶龍;韓金龍;常有宏;;植物HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能[J];遺傳;2013年10期

本文編號(hào)：2765798