水稻OsVDAC4互作蛋白篩選及OsVDAC5啟動子表達模式分析
發(fā)布時間：2020-07-22 12:12
【摘要】：電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channels,VDACs)是廣泛存在于線粒體上的一種孔道蛋白,可以控制代謝產物、無機鹽的運輸,維持內環(huán)境的穩(wěn)態(tài),并與細胞凋亡有關。本實驗室前期鑒定出了8種水稻VDAC蛋白,本實驗主要圍繞OsVDAC4和OsVDAC5來進行,主要取得以下2個方面結果:1.將OsVDAC4全長序列連接兩個誘餌蛋白載體pBT3-N和pBT3-SUC,膜蛋白酵母雙雜交結果表明pBT3-SUC-OsVDAC4可用于文庫篩選。從YTB幼穗cDNA文庫中篩選出4個可能與OsVDAC4互作的蛋白,進一步點對點雜交實驗證明只有LOC_Os02g06640.1和LOC_Os06g51220.2與OsVDAC4互作,暫命名為OsV4IP1和OsV4IP2。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)OsV4IP1蛋白有14次或是22次跨膜,或是沒有跨膜。OsV4IP2蛋白沒有跨膜結構。OsV4IP1和OsV4IP2都定位在核上。2.對OsVDAC5的ATG上游4500 bp序列進行生物信息學分析后,將其分為4個5'部分缺失片段pB、pC、pD和pE。將4個片段分別連接雙元表達載體DX2181,通過農桿菌介導得到轉基因陽性植株。目前只得到了pC、pD和pE表達GFP的陽性植株。對部分植株進行熒光觀察結果表明pC、pD和pE在根的厚壁組織、內皮層、中柱表達,pC和pD在葉的表皮和中柱,葉鞘的韌皮部、葉舌、葉節(jié),穎殼,花蕊表達。在根的皮層薄壁組織,葉肉,葉鞘內部都不表達。
【學位授予單位】：中南民族大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;S511
【圖文】：
圖 1.2 VDAC 信號通路圖(DeHart et al., 2018a)Fig 1.2 Graphical of VDAC signal pathway(DeHart et al., 2018a)DACs 的其他功能科植物中，有研究表明膜脂調節(jié) VDAC 的功能。磷脂是 PcV節(jié)因子，并且鹽濃度也對此有影響(Mlayeh et al., 2017)。釀蛋白 Por1 和 Por2 正向調節(jié) AMPK/Snf1 催化激活，且 Ponf1 核定位的過程中也起到重要作用(Shevade et al., 2018)。分子與 yVDAC1 相比，yVDAC2 具有不同數(shù)量的鉀離子和氯離子ni et al., 2018)。以粗糙脈孢菌作為研究對象，將 VDAC 的 N 末2-12porin 被組裝到外膜，結果發(fā)現(xiàn)與野生型相比蛋白質的水平電子傳遞鏈缺陷、交替氧化酶表達以及生長速率下降(S研究表明在小鼠中，敲除 VDAC3 會導致活性氧(reactive oxyg加，改變腎臟鈉的運輸，導致高血壓(Zou et al., 2018)。神經
中南民族大學碩士學位論文嘗試構建部分 OsVDACs 的 RNAi 植株，并取得初步成功（江晨，2011）。之后對 OsVDACs 的原核、真核表達進行了研究（熊杰，2012；劉洋，2014）。并對OsVDACs 進行了亞細胞定位（鐘英健，2015）。通過膜蛋白酵母雙雜交技術從YTB 幼穗 cDNA 文庫中篩選到了 OsVDAC3 的 3 個互作蛋白，成功得到了OsVDAC3 超表達植株（胡穎，2015）。并進一步驗證了 OsVDAC3 與其互作蛋白間的互作（程英，2017）。成功得到 OsVDAC5 的 RNAi 轉基因植株，并篩選得到了 7 個與 OsVDAC5(1-75aa)互作的蛋白（諶鑫，2015），將其命名為OsV5IP1-7，為了探索 OsVDAC5(1-75aa)與 OsV5IP1-7 是否真正互作，還進行了酵母雙雜、pull down、BiFC 實驗，實驗結果顯示它們之間發(fā)生了互作（李雙紅，2016）。OsVDAC5 互作蛋白的亞細胞定位實驗顯示 OsV5IP2-5 定位于線粒體，OsV5IP1、6、7 定位于細胞質（吝婷婷，2017）。
要檢測誘餌蛋白載體的自激活活性。這種酵母雙雜交互作。分離-泛素系統(tǒng)(split-ubiquitin system)是利用泛泛素蛋白的第 34-76 氨基酸）和 NubI（包含泛素蛋白征進行的。Cub 與 NubI 在自然條件下可以形成完整 突變成 NubG 之后，Cub 與 NubG 在自然條件下難以形白酵母雙雜交就是基于泛素的這個特性來篩選互作蛋 Cub，待篩選的蛋白連接泛素的 NubG，當兩者發(fā)生，形成完整的泛素蛋白，完整的泛素蛋白被泛素特異性A-VP16 從 NubG-Cub-LexA-VP16 復合體上切下，LexDNA 結合結構域結合到與之對應的順式作用元件上，域，LexA-VP16 復合體啟動報告基因的表達，例如 E2、HIS3 報告基因的表達可以使酵母在 SD-4 培養(yǎng)基苷酶，用 X-gal 進行顯色反應可以顯出藍色。
本文編號：2765798
【學位授予單位】：中南民族大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;S511
【圖文】：
圖 1.2 VDAC 信號通路圖(DeHart et al., 2018a)Fig 1.2 Graphical of VDAC signal pathway(DeHart et al., 2018a)DACs 的其他功能科植物中，有研究表明膜脂調節(jié) VDAC 的功能。磷脂是 PcV節(jié)因子，并且鹽濃度也對此有影響(Mlayeh et al., 2017)。釀蛋白 Por1 和 Por2 正向調節(jié) AMPK/Snf1 催化激活，且 Ponf1 核定位的過程中也起到重要作用(Shevade et al., 2018)。分子與 yVDAC1 相比，yVDAC2 具有不同數(shù)量的鉀離子和氯離子ni et al., 2018)。以粗糙脈孢菌作為研究對象，將 VDAC 的 N 末2-12porin 被組裝到外膜，結果發(fā)現(xiàn)與野生型相比蛋白質的水平電子傳遞鏈缺陷、交替氧化酶表達以及生長速率下降(S研究表明在小鼠中，敲除 VDAC3 會導致活性氧(reactive oxyg加，改變腎臟鈉的運輸，導致高血壓(Zou et al., 2018)。神經
中南民族大學碩士學位論文嘗試構建部分 OsVDACs 的 RNAi 植株，并取得初步成功（江晨，2011）。之后對 OsVDACs 的原核、真核表達進行了研究（熊杰，2012；劉洋，2014）。并對OsVDACs 進行了亞細胞定位（鐘英健，2015）。通過膜蛋白酵母雙雜交技術從YTB 幼穗 cDNA 文庫中篩選到了 OsVDAC3 的 3 個互作蛋白，成功得到了OsVDAC3 超表達植株（胡穎，2015）。并進一步驗證了 OsVDAC3 與其互作蛋白間的互作（程英，2017）。成功得到 OsVDAC5 的 RNAi 轉基因植株，并篩選得到了 7 個與 OsVDAC5(1-75aa)互作的蛋白（諶鑫，2015），將其命名為OsV5IP1-7，為了探索 OsVDAC5(1-75aa)與 OsV5IP1-7 是否真正互作，還進行了酵母雙雜、pull down、BiFC 實驗，實驗結果顯示它們之間發(fā)生了互作（李雙紅，2016）。OsVDAC5 互作蛋白的亞細胞定位實驗顯示 OsV5IP2-5 定位于線粒體，OsV5IP1、6、7 定位于細胞質（吝婷婷，2017）。
要檢測誘餌蛋白載體的自激活活性。這種酵母雙雜交互作。分離-泛素系統(tǒng)(split-ubiquitin system)是利用泛泛素蛋白的第 34-76 氨基酸）和 NubI（包含泛素蛋白征進行的。Cub 與 NubI 在自然條件下可以形成完整 突變成 NubG 之后，Cub 與 NubG 在自然條件下難以形白酵母雙雜交就是基于泛素的這個特性來篩選互作蛋 Cub，待篩選的蛋白連接泛素的 NubG，當兩者發(fā)生，形成完整的泛素蛋白，完整的泛素蛋白被泛素特異性A-VP16 從 NubG-Cub-LexA-VP16 復合體上切下，LexDNA 結合結構域結合到與之對應的順式作用元件上，域，LexA-VP16 復合體啟動報告基因的表達，例如 E2、HIS3 報告基因的表達可以使酵母在 SD-4 培養(yǎng)基苷酶，用 X-gal 進行顯色反應可以顯出藍色。
【參考文獻】
相關期刊論文 前1條
1 王宏;李剛波;張大勇;藺經;盛寶龍;韓金龍;常有宏;;植物HD-Zip轉錄因子的生物學功能[J];遺傳;2013年10期
本文編號：2765798
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