發(fā)布時(shí)間：2020-07-21 18:07

【摘要】：作為植物進(jìn)行光合作用和能量轉(zhuǎn)化的細(xì)胞器,葉綠體在維持地球生物生存和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái),隨著基因測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,越來(lái)越多植物的葉綠體基因組信息得以解析。目前,基于葉綠體基因組的植物精準(zhǔn)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究得到了越來(lái)越多研究者的青睞,被認(rèn)為是植物鑒定與發(fā)育關(guān)系研究的一種有效手段。鑒于葉綠體基因組的重要性,本研究基于二代測(cè)序技術(shù)完成了茅蒼術(shù)、北蒼術(shù)、白術(shù)、微花藤、益母草5種常用藥用植物的葉綠體基因組測(cè)序工作,并基于獲得的葉綠體基因組序列進(jìn)一步分析了各物種葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特征、葉綠體基因組的基因組成和葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)變異情況�？偟膩�(lái)說(shuō),本研究的研究結(jié)果主要可以分為以下4個(gè)方面:1、本研究首次獲得了茅蒼術(shù)、北蒼術(shù)和白術(shù)3個(gè)蒼術(shù)屬藥用植物的葉綠體基因組序列,繪制了其葉綠體基因組圖譜,解析了其基因組結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上,本研究又開(kāi)發(fā)了可以有效區(qū)分這三個(gè)蒼術(shù)屬物種的分子標(biāo)記,并在15個(gè)蒼術(shù)屬個(gè)體中驗(yàn)證了本研究所開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記真實(shí)有效。2、本研究構(gòu)建了一套基于二代測(cè)序reads的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)系統(tǒng)。該方法基于種間核苷酸多樣性大、種內(nèi)核苷酸多樣性小、兩者之間差值大和包含Poly序列少四項(xiàng)基本原則評(píng)估分子標(biāo)記區(qū)間PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的成功率。本研究基于該方法進(jìn)行了蒼術(shù)屬分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā),結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于該方法開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記與蒼術(shù)屬分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的結(jié)果相一致。結(jié)果表明,本研究構(gòu)建的基于二代測(cè)序reads的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)系統(tǒng)具有一定的可靠性。3、本研究首次獲得了茶茱萸科藥用植物微花藤的葉綠體基因組序列,并分別基于葉綠體基因組的蛋白編碼序列、完整核苷酸序列和ITS序列分析了微花藤及其近源物種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,為實(shí)現(xiàn)該物種的精準(zhǔn)鑒定及其系統(tǒng)進(jìn)化研究提供了數(shù)據(jù)支撐。結(jié)果表明微花藤與絞木目的杜仲關(guān)系相較于它與冬青目、無(wú)患子目和衛(wèi)矛目的關(guān)系更為密切。4、本研究首次獲得了益母草屬第一個(gè)完整的葉綠體基因組。益母草葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)和基因組成具有高度的保守性,不存在類似豆科、桔�？频瓤茖買R區(qū)缺失、收縮或擴(kuò)張的現(xiàn)象。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析,本研究確定了益母草在野芝麻亞科中的系統(tǒng)進(jìn)化位置,結(jié)果表明益母草屬與水蘇屬進(jìn)化關(guān)系比較近。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S567
【圖文】：

圖］－２近３０年來(lái)植物葉綠體基因組測(cè)序完成情況逡逑如圖１－２所示，１９８６年為葉綠體基因組測(cè)序的開(kāi)局之年，在這一年來(lái)自日本的逡逑研究者首次完成了煙草和地錢兩種陸生植物的葉綠體基因組測(cè)序工作。在此之后２０逡逑年間的，葉綠體基因組測(cè)序研究一直不溫不火。直到２００６年開(kāi)始，葉綠體基因組逡逑測(cè)序工作才開(kāi)始有了起色。在此后的７年間，每年釋放的葉綠體基因組數(shù)據(jù)維持在逡逑２３－５７之間。值得注意的是，從２０１３年開(kāi)始，葉綠體基因組測(cè)序研宄迎來(lái)了嶄新的逡逑局面。自這一年開(kāi)始，每年釋放的葉綠體基因組數(shù)據(jù)都成倍增加。縱觀葉綠體基因逡逑組測(cè)序研宄的發(fā)展史，可將近３０年來(lái)的葉綠體基因組測(cè)序工作劃分為３個(gè)階段。逡逑１９８６年－２００５年為第一個(gè)階段，在這個(gè)階段采用的測(cè)序技術(shù)為以雙脫氧鏈終止法為逡逑核心的第一代測(cè)序技術(shù)。煙草、玉米等早期葉綠體全基因組序列的獲得，是通過(guò)將逡逑純化的葉綠體ＤＮＡ隨機(jī)打斷或酶切后克隆到載體中，再以Ｓａｎｇｅｒ法對(duì)含有葉綠體逡逑ＤＮＡ片段的克隆載體進(jìn)行測(cè)序［５７］。第一代測(cè)序技術(shù)避免了分離提取葉綠體基因組逡逑測(cè)序ｒｅａｄｓ的步驟，可以獲得完整的葉綠體基因組序列。但是測(cè)序效率低、成本高、逡逑且難以完成微量ＤＮＡ樣品的測(cè)序工作［５８］。第一代測(cè)序技術(shù)的局限性在很大程度上逡逑限制了葉綠體基因組測(cè)序工作的開(kāi)展，因此出現(xiàn)了維持近２０年的葉綠體基因組測(cè)逡逑

子共有１０，９２２個(gè)。在這些密碼子中，出現(xiàn)頻率最高和最低的分別是編碼異亮氨酸和逡逑半胱氨酸的密碼子，分別有Ｕ５２個(gè)（１０．５５％）和１１４個(gè)（１．０４％邋）密碼子（表Ｓ４）。逡逑圖２－２和表Ｓ４總結(jié)了基因組中蛋白質(zhì)編碼基因的密碼子使用情況。圖２－２顯示三個(gè)逡逑物種中同義密碼子的相對(duì)使用度（ＲＳＣＵ）是相似的，并且ＲＳＣＵ值隨著編碼特定逡逑氨基酸的密碼子數(shù)量的X椉傭黽印４送猓諞堵?tīng)C寤蜃櫚牡鞍字時(shí)嗦肭ǎ茫模櫻╁義夏�，盟炿讚砟嫡浕，翟滯和抵R轡壞模粒院糠直鷂擔(dān)福常玻�，６３．１８％和６８．２０％。辶x轄峁礱髟諉藶胱擁諶轡淮嬖詬擼粒院康鈉瞇�，这种现象和茰O降刂參鍤清義俠嗨頻模郟梗常蕁ｅ義希稿義希ィュ澹ュ渭蒎義希掊澹村危苠義希海潁�、气秦？辶x希洛鍤W邐Ａ邋ｔｒａｃ邋ｔｙｌｏ邋ｄｅｓ邋ｃｈｉｎｅ邋ｎｓ邋ｉｓ邐Ｊ逡逑ｌａＢＢ邐ｒｐｓＳ邐ＩｍＫ－ＵＵＵ逡逑ｉ邋ｉ邋＼邐似

多態(tài)性區(qū)域通�？捎糜诜肿訕�(biāo)記的開(kāi)發(fā)，而且針對(duì)這些區(qū)域設(shè)計(jì)合適的引物操逡逑作也很簡(jiǎn)單ｌ２７，９７ｊ。本研究中我們根據(jù)三個(gè)葉綠體基因組的比對(duì)結(jié)果選擇了邋１２處多逡逑態(tài)性較高的區(qū)域作為開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的候選區(qū)間（圖２－６）。為了驗(yàn)證１２個(gè)候選分子逡逑標(biāo)記區(qū)間能否正確區(qū)分三個(gè)蒼術(shù)屬物種中候選標(biāo)記區(qū)域的變異性，我們使用１２對(duì)逡逑引物對(duì)三個(gè)物種共１５個(gè)樣品ＤＮＡ邋（每個(gè)物種５個(gè)個(gè)體）進(jìn)行了邋ＰＣＲ擴(kuò)增譜的分析逡逑（表Ｓ１－Ｓ２）。結(jié)果表明，所有ＰＣＲ產(chǎn)物均具有明亮的單一條帶，但只有一對(duì)引物逡逑（引物ＣＺ１１）可以成功測(cè)序，其余ＰＣＲ產(chǎn)物均具有ＰｏｌｙＡ／Ｔ結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果逡逑不穩(wěn)定或測(cè)序失敗。為驗(yàn)證引物１１的鑒定效率和穩(wěn)定性，我們利用該引物對(duì)三種逡逑物種共１５個(gè)個(gè)體樣品ＤＮＡ進(jìn)行ＰＣＲ實(shí)驗(yàn)。然后對(duì)１５個(gè)ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，每逡逑個(gè)ＰＣＲ產(chǎn)物重復(fù)測(cè)３次。圖２－７顯示了邋４５個(gè)ＰＣＲ測(cè)序序列部分長(zhǎng)度的比對(duì)結(jié)果。逡逑結(jié)果顯示三個(gè)物種的序列彼此可以清楚的區(qū)分開(kāi)來(lái)，茅蒼術(shù)和北蒼術(shù)相比具有５ｂｐ逡逑的’ＴＡＴＡＴ’插入序列，白蒼術(shù)和北蒼術(shù)相比具有６ｂｐ的＇ＴＣＴＴＡＣ’插入序列。更有意逡逑思的是我們發(fā)現(xiàn)茅蒼術(shù)和白術(shù)五個(gè)樣品利用引物ＣＺ１１擴(kuò)增的ＰＣＲ產(chǎn)物的序列之間逡逑是一致的

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2764616