【摘要】：丹參連作障礙已成為制約藥用植物丹參生產(chǎn)的一大因素,丹參連作障礙不僅影響丹參的產(chǎn)量,而且降低丹參主要藥用成分丹酚酸B和丹參酮的含量。miRNA是一類(lèi)非編碼小分子RNA,主要通過(guò)與靶基因互作,在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。為了從miRNA角度探討丹參miRNA在丹參連作障礙及次生代謝合成調(diào)控中的作用,本研究通過(guò)miRNA高通量測(cè)序技術(shù)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),對(duì)響應(yīng)丹參連作的miRNA進(jìn)行系統(tǒng)分析,進(jìn)而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗(yàn)證miR164a對(duì)化感自毒物質(zhì)的耐受性及其在丹參次生代謝合成中的作用展開(kāi)深入地分析,取得如下主要結(jié)果:(1)通過(guò)高通量測(cè)序獲得了丹參連作和非連作兩個(gè)miRNA庫(kù),第一年種植丹參根miRNAs(FPR)和連作丹參根miRNAs(SPR)。從兩個(gè)庫(kù)中鑒定了110條已知的miRNAs和7條新的miRNAs,其中39條已知的和兩條新的miRNA在兩個(gè)庫(kù)中差異表達(dá),通過(guò)生物信息學(xué)軟件和降解組數(shù)據(jù)分析它們的靶基因,并經(jīng)qRT-PCR對(duì)這些差異miRNA及靶基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。同時(shí)對(duì)第一年種植和連作丹參的丹酚酸和丹參酮含量進(jìn)行測(cè)定,最終確定了miR160a和miR164a極可能參與了丹參連作障礙的應(yīng)答以及對(duì)丹參酚酸和丹參酮的調(diào)控。(2)為了驗(yàn)證miR164a在丹參中的生物學(xué)功能及作用機(jī)制,我們構(gòu)建了miR164a的過(guò)表達(dá)載體并獲得了miR164a過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因毛狀根,用終濃度為5-100μg/mL的對(duì)羥基肉桂酸(模擬連作障礙中的化感物質(zhì))處理,與野生型毛狀根相比,miR164a過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)對(duì)羥基肉桂酸具有顯著的耐受性。此外,我們還發(fā)現(xiàn),miR164a過(guò)表達(dá)的毛狀根中生物量?jī)H為野生型的32.43-47.84%;丹參酮IIA(T-IIA)的含量也降為野生型的53%-66%。但是丹酚酸B的含量在過(guò)表達(dá)毛狀根中明顯高于野生型。這些結(jié)果表明miR164a可能通過(guò)負(fù)調(diào)控SmNAC2和SmNAC3,促進(jìn)植物對(duì)連作障礙的抗性及丹酚酸B的合成。(3)利用psRNAtarget預(yù)測(cè)miR164a的靶基因?yàn)镾mNAC2和SmNAC3,通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化方法分別獲得了SmNAC2和SmNAC3的過(guò)表達(dá)(OE-NAC2和OE-NAC3)及沉默表達(dá)(RNAi-NAC2和RNAi-NAC3)轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根,與野生型相比,OE-SmNAC2-1,2兩個(gè)株系中丹參酮Ⅰ(T-Ⅰ)分別下降到野生型的59.31%和52.68%,T-ⅡA含量下降到65.4%和59.28%,丹酚酸B含量沒(méi)有明顯變化;而RNAi-NAC2-1和RNAi-NAC2-2的T-Ⅰ分別增加為野生型的4.22和3.14倍,T-ⅡA分別增加為野生型的3.10和5.09倍,丹酚酸B含量增加了2.43和3.21倍。OE-SmNAC3轉(zhuǎn)基因毛狀根中OE-NAC3-2和OE-NAC2-3的T-Ⅰ分別增加為野生型的5.68和5.11倍,T-ⅡA分別增加為野生型的10.03和7.54倍,而丹酚酸B的含量降低到54.5%和75.26%;RNAi-NAC3-1和RNAi-NAC3-2的T-Ⅰ則分別降低為野生型的24.56%和23.34%,T-ⅡA為野生型的46.15%和30.5%,而丹酚酸B的含量增加了1.47和1.25倍。以上結(jié)果顯示SmNAC3對(duì)T-ⅡA正調(diào)控而對(duì)丹酚酸B是負(fù)調(diào)控根據(jù)miRNA對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)控原理,由于miR164a對(duì)丹酚酸B是正調(diào)控而對(duì)T-IIA是負(fù)調(diào)控,它的靶基因應(yīng)該對(duì)T-ⅡA正調(diào)控而對(duì)丹酚酸B是負(fù)調(diào)控,因此SmNAC3可能在miR164a的兩個(gè)靶基因中發(fā)揮著主要作用。(4)為了驗(yàn)證miR160a在丹參酮、丹酚酸合成通路中的調(diào)控作用,構(gòu)建了miR160a的過(guò)表達(dá)載體并獲得了miR160a過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因毛狀根。與野生型毛狀根相比,miR160a過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因毛狀根生物量顯著增加,是野生型的1.5-1.9倍;丹參酮含量顯著降低,甚至有的株系未檢測(cè)到丹參酮,丹參酮合成通路關(guān)鍵酶基因的表達(dá)也被顯著抑制;而丹酚酸B的含量增加了1.3-1.9倍。進(jìn)一步檢測(cè)生長(zhǎng)素(Indoleacetic acid,IAA)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)和水楊酸(Alicylic acid,SA)含量,結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因毛狀根中IAA含量增加,而JA和SA含量降低,推測(cè)miR160a也許通過(guò)影響植物激素含量而負(fù)調(diào)控了丹參酮的生物合成。綜上所述,本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析了丹參連作和非連作下miRNA的表達(dá)譜,并對(duì)篩選出的響應(yīng)連作障礙的miRNAs進(jìn)行了深入系統(tǒng)的分析,驗(yàn)證了miR164a及其靶基因和miR160a可能的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制,研究結(jié)果為進(jìn)一步研究丹參的miRNA的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為進(jìn)一步闡明丹參連作障礙和次生代謝物合成調(diào)控機(jī)制提供重要線索。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S567.53
【圖文】：

物中 miRNA 概述iRNA是生物體內(nèi)普遍存在的內(nèi)源、非編碼小分子RNA，它的前體具有發(fā) et al.2004;Ambros et al.2003)。miRNA長(zhǎng)度約16~29 nt，平均22 nt，大部分ng et al. 2009)。miRNA是一類(lèi)負(fù)調(diào)控因子，主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因與靶基因幾乎完全互補(bǔ)降解靶基因mRNA，或與靶基因mRNA不完全配對(duì)翻譯(Lai et al.2003;Baohong et al.2006)。物中 miRNA 的生源合成途徑與植物不同，動(dòng)物 miRNA 在聚合酶Ⅱ作用初級(jí)miRNA(pri-miRNA)，然后被一種稱(chēng)為Drosha的RNA酶Ⅲ及輔助因環(huán)結(jié)構(gòu)的前體 pre-miRNA。植物中沒(méi)有 Drosha 同源類(lèi)似物，這個(gè)過(guò)程是在L1 作用下完成的(Millar et al.2005; Olivier 2009;秦彤 等 2011)。Pre-min-5 作用下進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后被 Dicer 切割，pre-miRNA 的環(huán)狀結(jié)構(gòu)被切iRNA/miRNA*雜合雙鏈分子。雙鏈體分子與 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中，miRNA*鏈解離，另一條與 AGO 蛋白結(jié)合稱(chēng)為成熟單鏈 miRNA(Kashilliam et al.2010;Olivier 2009)。圖 1-1 為植物 miRNA 生源合成途徑。

CYP98A78（CYP98A14的等位基因變異型）作為特定的羥化酶催化4-香豆酰-3', 4'-二羥基-苯乳酸生成迷迭香酸(Chen et al. 2014; Di et al. 2013, 2017a)。目前從迷迭香酸到丹酚酸B及丹參素的合成路徑還不清楚，也是目前丹酚酸生物合成路徑中的瓶頸難題。圖1-2顯示了丹參中迷迭香酸生物合成途徑及從迷迭香酸到丹酚酸B的可能途徑。丹參酮的生物合成途徑主要包括細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸途徑（mevalonate，MVA）和質(zhì) 體 中 的 非 甲 羥 戊 酸 途 徑 （ 2-C-methyl-d-erythritol-4-phosphate ， MEP ） (Ma etal.2015;Vranová et al.2013;Cheng et al.2013)（圖 1-3）。很多丹參酮生物合成相關(guān)基因，如 HMGR、DXS、DXR、GGPPS、FPPS、IPPI、CPS 和 KSL，已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者成功克隆并采用轉(zhuǎn)基因的手段研究了它們?cè)诘⑼铣陕窂街械淖饔?Cui et al.2011;李瀅 等2010a;Hua et al.2011;Yang et al.2013; Dai et al.2011;Gao et al.2009)。近些年來(lái)，丹參毛狀根已經(jīng)成為研究丹參酮和丹酚酸生物合成與調(diào)控的一種方便有效的材料(Hu et al.1993;Wang et al.2010;Jian et al.2010)。人們采用多種誘導(dǎo)子誘導(dǎo)丹參毛狀根中丹參酮和丹酚酸的積累，如生物誘導(dǎo)子，重金屬離子（Co2+,Ce，Ag+,Cd2+）(Zhang et al.2004; Ge et al. 2005; Zhao et al. 2010; Xing et al. 2014; 韓名宇 等 2015) 和植物激素類(lèi)物質(zhì)（脫落酸和茉莉酸甲酯）等(Zhao et al.2010;Chen et al. 1999; Liang et al.2012 ;Yang et al. 2012 ;Huang et al.2017)

圖 1-3 丹參酮生物合成途徑(李瀅等 2010)Figure 1-3 Biosynthetic pathway of tanshinone究的目的與意義傳統(tǒng)中藥材，丹參中主要有效成分是丹酚酸B和丹參酮一。丹參連作障礙不僅導(dǎo)致丹參產(chǎn)量下降，而且嚴(yán)重的活性成分含量降低。見(jiàn)植物如擬南芥、煙草和水稻等miRNA研究的擴(kuò)大和究也迅速展開(kāi)，在半夏、人參、地黃和紅豆杉等藥用生物信息學(xué)手段對(duì)其功能做了預(yù)測(cè)，一些miRNA除了脅迫外，還參與了藥用植物次生代謝的調(diào)控。但是對(duì)不是很深入，藥用植物中miRNA的生物學(xué)功能研究也究?jī)H限于描述性質(zhì)的，即miRNAs的發(fā)現(xiàn)及靶基因的用機(jī)制。

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