【摘要】：本研究基于已發(fā)表的三七(Panax notoginseng)葉綠體基因組,開發(fā)分子標(biāo)記,對(duì)9個(gè)三七栽培居群,共計(jì)89份樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析。9個(gè)取樣地分別為:文山市、硯山縣、麻栗坡縣、馬關(guān)縣、丘北縣、廣南縣、建水縣與蒙自縣。DNA從三年生三七新鮮葉片提取,提取方法為CTAB法與試劑盒法。本研究所用分子標(biāo)記由cpSSR(chloroplast simple sequence repeat)、cpDNA(chloroplast deoxyribonucleic acid)多態(tài)性位點(diǎn)與matK基因三種類型組成。通過搜索三七cpDNA,獲得90個(gè)cpSSRs,引物設(shè)計(jì)成功的有7對(duì)(cpSSR-1~7),6對(duì)可擴(kuò)增條帶,引物cpSSR-5凝膠結(jié)果顯示明顯條帶差異性。cpSSR以三堿基重復(fù)類型為主,占比70~71%;二堿基重復(fù)最少,占比7%。比較cpSSR分布位置,分布于基因區(qū)的cpSSR占比高于基因間區(qū)�；谥貜�(fù)單元的類型與重復(fù)次數(shù)差異,確定研究重點(diǎn)區(qū)域?yàn)?psbJ-psbL、rpl14-rpl16和ycf1�；谌卟煌琧pDNA序列比對(duì)結(jié)果,共獲得30個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(14個(gè)In Dels與16個(gè)SNPs),獲得11對(duì)引物。多態(tài)性位點(diǎn)在基因間區(qū)的分布高于基因區(qū),這與cpSSR的分布相反。根據(jù)基因區(qū)或基因間區(qū)含有多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)目,確定研究重點(diǎn)區(qū)域?yàn)?trnH(GUG)-psbA、psbM-trnD(GUC)、rpl14-rpl16、atpF-atpH、psbZ與ycf1。這與cpSSR確定研究重點(diǎn)區(qū)域rpl14-rpl16和ycf1重疊,將作為本研究重點(diǎn)分析區(qū)域。根據(jù)DNA凝膠電泳的結(jié)果區(qū)分度,本研究將重點(diǎn)放在cpInDel(chloroplast insertion-deletion);并確定引物pgcp019與pncp08可用于三七栽培居群的區(qū)分。本研究重點(diǎn)是基于三七cpDNA多態(tài)性位點(diǎn)開發(fā)分子標(biāo)記。在確定的多態(tài)性位點(diǎn)中,不包含matK基因,考慮到matK基因是常用分子標(biāo)記,設(shè)計(jì)matK基因作為對(duì)照(驗(yàn)證本研究確定多態(tài)性位點(diǎn)是否可靠)。matK基因凝膠電泳結(jié)果并未觀察到明顯的條帶差異性,考慮到凝膠電泳的區(qū)分度(SNP與InDels小于5 bp難以觀測(cè)),需要通過測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證。ycf1基因作為重點(diǎn)研究區(qū)域,亦作為matK基因?qū)φ罩�。ycf1基因從凝膠結(jié)果明顯可見差異性,但存在非特異性條帶,未對(duì)其進(jìn)一步研究。本研究確定對(duì)cpSSR-5、pgcp019、pncp08與pncp-M(matK基因引物)四對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果測(cè)序�；跍y(cè)序結(jié)果,引物cpSSR-5確定2種SNP單倍型與10種InDel單倍型,可區(qū)分4個(gè)栽培居群;引物pgcp019劃定SNP與In Del的單倍型種類分別為5與7,可區(qū)分5個(gè)栽培居群;引物pncp08獲得4種In Del單倍型,可區(qū)分2個(gè)栽培居群;引物pncp-M劃分SNP單倍型9種,InDel單倍型14種,可區(qū)分居群數(shù)為6�；诒狙芯拷Y(jié)果,引物pgcp019與matK基因都具有一定程度的區(qū)分居群效果。這說明本研究確定多態(tài)性區(qū)域,具有一定的參考價(jià)值。基于引物pgcp019與matK基因測(cè)序結(jié)果,構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹,分別聚為4個(gè)與6個(gè)類群。從劃定的類群與單倍型種類出發(fā),引物pncp-M的區(qū)分效果優(yōu)于引物pgcp019。但綜合考慮(綜合序列長(zhǎng)度、群體π值和平均核苷酸差異數(shù)等指標(biāo))表明引物pgcp019區(qū)分居群效果優(yōu)于matK基因�；谒膶�(duì)引物測(cè)序結(jié)果,采用SNP與InDel分別獲得單倍型,通過組合,得到39種組合單倍型。根據(jù)居群內(nèi)特有組合單倍型,可區(qū)分9個(gè)栽培居群�；诰尤簝�(nèi)組合單倍型數(shù)目,確定居群3(麻栗坡縣)的遺傳多樣性最高。
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S567.236;Q943.2
【圖文】：

DNA提取結(jié)果（部分）

圖Fig. 3顏色代表不同三七葉綠體型的 cpSSR 在四個(gè)A 占比不同；其中同三七 cpSSR cpSSR 重復(fù)單元與出現(xiàn)次數(shù)，橫坐標(biāo)表示該類型重復(fù)單元在其中不同顏色代表不同基因組“T”出現(xiàn)次數(shù)都為 8 個(gè)；出現(xiàn)次數(shù)位居第二的是一致（6 個(gè)）。單堿基3.1 cpSSR 堿基類型所占比例3.1 The rate of different types of cpSSR顏色代表不同三七葉綠體 cpDNA，分別以 KJ、KP、KR 與 KTcpDNA 的占比相同，單堿基與三堿基重復(fù)類型其中，三堿基重復(fù)類型的占比最大，二堿基重復(fù)的占差異分析重復(fù)單元與出現(xiàn)次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)�？v坐標(biāo)代表 cpSSR橫坐標(biāo)表示該類型重復(fù)單元在不同葉綠體基因組出現(xiàn)次不同顏色代表不同基因組。在所有類型重復(fù)單元中出現(xiàn)次數(shù)最多，除在 KT 葉綠體基因組中為 7 個(gè)出現(xiàn)次數(shù)位居第二的是“TAA”重復(fù)，在四個(gè)葉。重復(fù)單元在不同 cpDNA 出現(xiàn)次數(shù)存在差異二堿基 三堿基 四堿基代表單堿基與三堿基重復(fù)類型二堿基重復(fù)的占葉綠體基因組出現(xiàn)次重復(fù)單元中：個(gè)，在在四個(gè)葉差異

圖 3.4 cpSSR 的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果（部分）Fig. 3.4 The result of cpSSR PCR (part)（a），引物 cpSSR-5 擴(kuò)增結(jié)果，63℃，25s；（b），引物 cpSSR-6 擴(kuò)增結(jié)果條件與（a）一致；（c），cpSSR-7 擴(kuò)增結(jié)果，無條帶；（d），60℃，30s 條件下，cpSSR-1~6 擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)應(yīng)編號(hào)分別為，1、2，3，4、5，6，7、8，9。3.4.4 cpSSR 引物篩選結(jié)果使用經(jīng)過篩選的 6 對(duì) cpSSR 引物，在確定兩種 PCR 反應(yīng)條件下（60℃，30s；℃，25s），對(duì) 89 個(gè)樣品 PCR 擴(kuò)增。從條帶差異性來看，與 cpSSR 差異性預(yù)計(jì)果相似，6 對(duì)引物中有 5 對(duì)引物條帶無差異性。唯一具有條帶差異性的為引物SSR-5，編號(hào) 31-40，為樣地 4 的樣品，白色箭頭標(biāo)注 34 號(hào)樣品顯示差異性條圖3.5a）；編號(hào) 81-90 取自樣地 9，其中，84 號(hào)樣品具有差異性條帶（圖 3.5b）。外，通過本實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組，證明反應(yīng)體系沒有污染。引物 cpSSR-5：位于基因間區(qū) rps15-ycf1，重復(fù)單元為 CTC-3/ATT-3，預(yù)計(jì)片

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2758386