【摘要】：染色體結(jié)構(gòu)維持(structural maintenance of chromosome,SMC)蛋白在維持染色體形態(tài)特征結(jié)構(gòu)中有主要作用。真核生物中有6種SMC同源蛋白:SMC1-6。SMC蛋白主要以復(fù)合體的形式發(fā)揮功能。SMC蛋白兩兩形成異二聚體(SMC1與SMC3,SMC2與SMC4,SMC5與SMC6),再分別結(jié)合其他非SMC蛋白成分形成三種SMC蛋白復(fù)合體(凝聚蛋白、黏結(jié)蛋白和SMC5-SMC6復(fù)合體)。DNA雙鏈斷裂(double-strandbreak,DSB)是一種危害性很高的損傷形式。DSB可以發(fā)生于DNA復(fù)制期,或者暴露在造成DNA損傷的因素下。DSB的正確修復(fù)是細(xì)胞存活以及基因組穩(wěn)定性的基礎(chǔ)。真核生物細(xì)胞主要有兩種DSB修復(fù)機制:非同源末端連接(non-homologous end-joining,NHEJ)和同源重組(homologous recombination,HR)。根據(jù)修復(fù)過程中鏈侵入是否需要由RAD51重組酶的催化,同源重組修復(fù)又可以細(xì)分為兩種類型:需要 RAD51 重組酶的 synthesis-dependent strand annealing(SDSA)途徑以及不依賴RAD51重組酶的single-strand annealing(SSA)途徑。在酵母以及擬南芥中的研究表明,SMC1和SMC3蛋白參與DSB的修復(fù),但是具體作用機制尚不明確。而在水稻中,它們在DSB修復(fù)中的作用還沒有進(jìn)行系統(tǒng)研究。在本研究中,我們對水稻中SMC1以及SMC3基因的功能做了初步的探索,具體結(jié)果如下:1、成功構(gòu)建了SMC1、SMC3-1、SMC3-2和SMC3-基因的 CRISPR/Cas9 編輯載體,獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株,并通過自交的方法獲得純合的突變體株系。2、通過對水稻各組織中SMC1、SMC3-1、SMC3-2和SMC3-3基因表達(dá)量進(jìn)行Real-time PCR 分析,結(jié)果顯示 SMC1 和 SMC3-1 在水稻幼穗中 的表達(dá)量最高,而 SMC3-2和SMC3-3在葉片中有較高表達(dá)。3、SMC1和SMC3-1基因強突變類型的雜合體后代中不能獲得純合突變體,我們推測SMC1和SMC3-1基因強突變導(dǎo)致水稻胚胎致死。4、突變體以及野生型植株根尖的絲裂霉素敏感性實驗表明,smc1和smc3-3突變體相較于野生型對絲裂霉素敏感,水稻中可能是SMC1和SMC3-3基因?qū)忝萌旧珕误w之間的黏著更重要。5、博萊霉素敏感性實驗表明,smc1和smc3-2突變體相較于野生型對博來霉素敏感,表明SMC1和SMC3-2能夠參與DSB修復(fù)。6、γ射線照射以及博來霉素處理后Real-time PCR的結(jié)果顯示,smc1、smc3-2和smc3-3突變體中HR和NHEJ修復(fù)路徑中相關(guān)基因的表達(dá)量相較于野生型有顯著變化,表明SMC1和SMC3可以通過HR或NHEJ路徑影響DSB的修復(fù)。7、根尖蛋白免疫結(jié)果發(fā)現(xiàn)smc3-3中RAD51A2蛋白信號的募集相比較于野生型有顯著減少,表明SMC3-3通過SDSA修復(fù)路徑參與DSB修復(fù)。8、我們通過適用于水稻體細(xì)胞重組修復(fù)率的檢測體系,對各個突變體進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SMC1、SMC3-2、和SMC3-3基因的突變會造成體細(xì)胞SSA重組修復(fù)率的降低,而只在smc3-3突變體中發(fā)現(xiàn)SDSA修復(fù)路徑受到影響。即:SMC1和SMC3-2參與SSA重組修復(fù)過程,SMC3-3同時參與SSA和SDSA重組修復(fù)過程。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S511
【圖文】：

ＳＭＣ蛋白Ｒａｄ２１／Ｓｃｃｌ和Ｓｃｃ３／ＳＡ構(gòu)成，ＳＡ蛋白在脊椎動物體細(xì)胞中又分為ＳＡ１以及ＳＡ２逡逑兩類。其中兩個ＳＭＣ蛋白形成一個反向二聚體，該二聚體的起始域與Ｒａｄ２１蛋白互作，逡逑完成封閉環(huán)結(jié)構(gòu)，Ｒａｄ２１再與ＳＡ結(jié)合，從而形成了完整的黏結(jié)蛋白復(fù)合體［２％邋（圖１．２）。逡逑黏結(jié)蛋白復(fù)合體參與姐妹染色單體的黏著、ＤＮＡ修復(fù)以及細(xì)胞周期中檢查點（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）逡逑的活化。逡逑黏結(jié)蛋白在Ｇ１期加載到染色質(zhì)上，Ｓｃｃ２和Ｓｃｃ４組成的蛋白復(fù)合體作為加載因子。在逡逑Ｓ期參與姐妹染色單體的黏著，對Ｍ期染色體的正確分離也有重要的作用＾］。黏結(jié)蛋白黏逡逑著力的形成需要激活“形成因子’’（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ邋ｆａｃｔｏｒ）Ｅｃｏｌ。絕大多數(shù)的黏結(jié)蛋白、相關(guān)蛋逡逑白（Ｗａｐｌ，Ｐｄｓ５等）以及加載因子（Ｓｃｃ２／ＳＣＣ４）都在細(xì)胞分裂前期時從染色體臂上被移除，逡逑其余附著在著絲粒上的黏結(jié)蛋白蛋白在后期被去除。黏結(jié)蛋白復(fù)合體可以有效防止姐妹染逡逑色單體的提前分離，因而在維持染色體穩(wěn)定性方面具有重要的意義。黏結(jié)蛋白在細(xì)胞分裂逡逑過程中的機制尚不明了，但普遍認(rèn)為其功能的發(fā)揮依賴于多個相關(guān)蛋白的協(xié)調(diào)作用。逡逑目前，關(guān)于黏結(jié)蛋白維持染色質(zhì)穩(wěn)定的機制主要有以下３種模型：單環(huán)模型（ｏｎｅｒｉｎｇ逡逑ｍｏｄｅｌ）、雙環(huán)模型（ｔｗｏ邋ｒｉｎｇ邋ｍｏｄｅｌ）以及多桿狀模型（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ邋ｒｏｄ－ｓｈａｐｅｄ邋ｍｏｄｅｌ）［川。逡逑單環(huán)模型認(rèn)為：黏結(jié)蛋白將兩個ｌ0ｎｍ長的姐妹染色單體纖維捕獲在一個三角形的環(huán)形結(jié)逡逑構(gòu)中。雙環(huán)模型提出：一個黏結(jié)蛋白環(huán)繞一條姐妹染色單體

邐ＣｏＵｅｄ－ｃｏｉｌ邐Ｃ－ｔｅｎｎｉｎａｌ逡逑圖１．１邋ＳＭＣ蛋白的基本結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇｌ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｂａｓｉｃ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＳＭＣ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑１．３邐黏結(jié)蛋白的生物學(xué)特征與功能逡逑黏結(jié)蛋白復(fù)合體最早發(fā)現(xiàn)于酵母細(xì)胞。該蛋白復(fù)合體含有４個亞基：即一對染色體結(jié)逡逑構(gòu)維持蛋白（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ邋ｏｆ邋Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ，邋ＳＭＣ）邋ＳＭＣ１邋和邋ＳＭＣ３，以及兩個非逡逑ＳＭＣ蛋白Ｒａｄ２１／Ｓｃｃｌ和Ｓｃｃ３／ＳＡ構(gòu)成，ＳＡ蛋白在脊椎動物體細(xì)胞中又分為ＳＡ１以及ＳＡ２逡逑兩類。其中兩個ＳＭＣ蛋白形成一個反向二聚體，該二聚體的起始域與Ｒａｄ２１蛋白互作，逡逑完成封閉環(huán)結(jié)構(gòu)，Ｒａｄ２１再與ＳＡ結(jié)合，從而形成了完整的黏結(jié)蛋白復(fù)合體［２％邋（圖１．２）。逡逑黏結(jié)蛋白復(fù)合體參與姐妹染色單體的黏著、ＤＮＡ修復(fù)以及細(xì)胞周期中檢查點（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）逡逑的活化。逡逑黏結(jié)蛋白在Ｇ１期加載到染色質(zhì)上，Ｓｃｃ２和Ｓｃｃ４組成的蛋白復(fù)合體作為加載因子。在逡逑Ｓ期參與姐妹染色單體的黏著，對Ｍ期染色體的正確分離也有重要的作用＾］。黏結(jié)蛋白黏逡逑著力的形成需要激活“形成因子’’（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ邋ｆａｃｔｏｒ）Ｅｃｏｌ。絕大多數(shù)的黏結(jié)蛋白、相關(guān)蛋逡逑白（Ｗａｐｌ，Ｐｄｓ５等）以及加載因子（Ｓｃｃ２／ＳＣＣ４）都在細(xì)胞分裂前期時從染色體臂上被移除，逡逑其余附著在著絲粒上的黏結(jié)蛋白蛋白在后期被去除。黏結(jié)蛋白復(fù)合體可以有效防止姐妹染逡逑色單體的提前分離

ｉ、、、、？／＿逡逑ＳＡ１／２邐＇逡逑圖１．２黏結(jié)蛋白結(jié)構(gòu)示意圖（根據(jù)參考文獻(xiàn)［２９】修改）逡逑Ｆｉｇｌ．２邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｃｏｈｅｓｉｎ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋（ｍｏｄｉｆｉｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ邋［２９］）逡逑Ｉ．

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