【摘要】：對比國內(nèi)外大豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展形勢和科學(xué)研究形勢,可知培育耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆品種,已成為我國實(shí)現(xiàn)大豆供需平衡的有效手段。草甘膦作為高效、低毒的廣譜性除草劑,一直備受青睞。AM79-EPSPS蛋白不僅具有較高的草甘膦耐受性,而且還保持著與PEP較強(qiáng)的親和性,能夠賦予植物對除草劑草甘膦的耐受性,是培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因作物極佳的選擇,目前尚未有在轉(zhuǎn)基因大豆中應(yīng)用的報導(dǎo)。本研究以天隆一號大豆為材料,從消毒時間、AS濃度、草甘膦濃度和蘸取IBA的時間等方面,探究并建立了高效的轉(zhuǎn)AM79-EPSPS耐除草劑基因大豆轉(zhuǎn)化體系。明確了當(dāng)種子消毒時間為6-8小時,AS濃度為200μM/L,草甘膦濃度為1OOμM/L,蘸取IBA的時間為30s時,轉(zhuǎn)化效果最好。根據(jù)該轉(zhuǎn)化體系開展了一批轉(zhuǎn)化并獲得6株陽性苗,采用ELISA技術(shù)篩選出了表達(dá)量最高的2個植株A6和A8。針對這兩個株系,采用RT-PCR技術(shù)證明了其后代不同時期不同組織中AM79-EPSPS均有表達(dá);通過Western blot證明了外源目的蛋白在其后代組織中能夠正常表達(dá);通過Southern blot驗(yàn)證了目的基因AM79-EPSPS以單拷貝的形式插入A6,A8基因組,且不同世代間整合穩(wěn)定。本研究還對AM79-EPSPS蛋白特征進(jìn)行了分析,其與已知的對人和哺乳動物有毒性的過敏原、毒蛋白或抗?fàn)I養(yǎng)因子無序列相似性,推測其不具有潛在的致敏性、毒性和抗?fàn)I養(yǎng)作用。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S565.1
【圖文】：

圖２．１所示），該載體只含有一個目的基因」Ｍ７９－五尸５７５基因表達(dá)盒，不含標(biāo)記逡逑基因和報告基因，ＳＰ序列為葉綠體信號肽序列，來源于豌豆（ＰｆｓｗｍｓａｆｔＶｗｗＬ．）。逡逑載體骨架載體來源于ＰＣＡＭＢＩＡ３３０１，在國際上已使用多年，沒有致病性也不可逡逑能演變?yōu)橛兄虏⌒�。逡逑Ｈｉｎｄｌｌｌ邋（２）邋ＰｓｔＩ邋（５４８）逡逑Ｔ－Ｂｏｒｄｅｒ邋（ｌｅｆｔ）邋／邐／逡逑．一＿邋／ｓｐ／邋ＢａｍＨＩ（７２５）逡逑ＫａｎａｍｙＣｉ＾｜＾邐Ｉ邋Ｓｍａｌ（１２１０）逡逑ｉ＾＾＾ＣａＡｎ＇３５Ｓ邋ｐｒｏｍｏｔｏｒ邐ＳｍａＩ邋（１２６？）逡逑ｐＢＲ３２２邋ｏｒｉ邋N邐ａｍ７９邋ｅｐｓｐｓｐ邐ＳｍａＩ邋（１８８５）逡逑ａｍ７９－ｐＣ３３０１邐ＳａｃＩ邋（２１０４）逡逑ｐＢＲ３２２邋ｂｏｍ邐ｎｏｓ邋ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ邐＾＾邋ＢｓｔＥＩＩ邋（２１０Ｓ）逡逑＼邐８７４５ｂｐ逡逑Ｖ邐ｊ邋Ｔ－ｂｏｒｄｅｒ邋（ｒｉｇｈｔ）逡逑ＰＶＳ１邐／逡逑ＰＶＳ１邋ｓｔａ逡逑圖２．１邐ＡＭ７９－ｐＣ３３０１載體圖譜逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｃａｒｒｉｅｒ邋Ｍａｐ邋ｏｆ邋ＡＭ７９－ｐＣ３３０１逡逑２．１．３實(shí)驗(yàn)所用試劑逡逑無水乙醇，二甲基亞楓，ＮａＣｌ，邋Ｎａ２ＥＤＴＡ，邋ＮａＯＨ，邋ＫＣ１，邋ＥＤＴＡ，邋ＮａＣＩＯ，逡逑甘油，異丙醇，氯仿，ＭＩＸ，鹽酸，硝酸鉀，硝酸銨，磷酸二氫鉀，七水硫酸鎂，逡逑無水氯化鈣，硫酸錳，硫酸鋅，碘化鉀，硼酸，氯化鈷，硫酸銅，鉬酸鈉，硫酸逡逑亞鐵，ＶＢ１，ＶＢ６，煙酸，肌醇，瓊脂粉（生工生物工程有限公司）；胰蛋白胨逡逑（ＯＸＯＩＤ）；酵母提取物（ＯＸＯＩＤ）

根據(jù)轉(zhuǎn)化載體Ｔ－ＤＮＡ區(qū)域序列，設(shè)計了邋ＰＣＲ檢測引物，上游引物位于３５Ｓ逡逑啟動子內(nèi)，下游引物位于目標(biāo)基因區(qū)域內(nèi)。通過ＰＣＲ方法檢測外逡逑源基因是否插入到大豆基因組ＤＮＡ，初步分析插入片段的整合情況。由圖３．１逡逑顯示，事件Ａ１－Ａ９中，除Ａ１，Ａ４，Ａ５外，其余事件均能夠擴(kuò)增到目標(biāo)片段，說明逡逑外源插入序列已經(jīng)整合到這幾個事件的大豆基因組中。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋Ａ１邋Ａ２邋Ａ３邋Ａ４邋Ａ５邋Ａ６邋Ａ７邋ＡＳ邋Ａ９邋Ｎ邋Ｐ邋ｂｐ逡逑：０００—．逡逑乃0邋—＾—６４５逡逑ｉ00逡逑圖３．１？０１１檢測圖（＾１：１＾＾１＾！＇；：＾陰忭受體材料；八１－六９：轉(zhuǎn)化所得大豆苗；？：質(zhì)粒）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．１邋Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ邋ｃｈａｉｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ逡逑３．２．２草甘膦抗性鑒定結(jié)果逡逑本實(shí)驗(yàn)的目的基因?yàn)榭共莞熟⒒�，通過噴施１倍中劑量濃度草甘膦對轉(zhuǎn)基逡逑因植株進(jìn)行初期抗性鑒定。噴施草甘膦兩周后，由圖３．２顯示，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沾箦义隙挂呀?jīng)枯萎，轉(zhuǎn)基因大豆幼苗能夠正常生長，表現(xiàn)出明顯的草甘膦抗性。將抗性逡逑轉(zhuǎn)基因大豆幼苗移栽至人工氣候區(qū)繼續(xù)培養(yǎng)，２－３個月后，收獲轉(zhuǎn)基因大豆種子逡逑備用。逡逑３１逡逑

根據(jù)轉(zhuǎn)化載體Ｔ－ＤＮＡ區(qū)域序列，設(shè)計了邋ＰＣＲ檢測引物，上游引物位于３５Ｓ逡逑啟動子內(nèi)，下游引物位于目標(biāo)基因區(qū)域內(nèi)。通過ＰＣＲ方法檢測外逡逑源基因是否插入到大豆基因組ＤＮＡ，初步分析插入片段的整合情況。由圖３．１逡逑顯示，事件Ａ１－Ａ９中，除Ａ１，Ａ４，Ａ５外，其余事件均能夠擴(kuò)增到目標(biāo)片段，說明逡逑外源插入序列已經(jīng)整合到這幾個事件的大豆基因組中。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋Ａ１邋Ａ２邋Ａ３邋Ａ４邋Ａ５邋Ａ６邋Ａ７邋ＡＳ邋Ａ９邋Ｎ邋Ｐ邋ｂｐ逡逑：０００—．逡逑乃0邋—＾—６４５逡逑ｉ00逡逑圖３．１？０１１檢測圖（＾１：１＾＾１＾！＇；：＾陰忭受體材料；八１－六９：轉(zhuǎn)化所得大豆苗；？：質(zhì)粒）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．１邋Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ邋ｃｈａｉｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ逡逑３．２．２草甘膦抗性鑒定結(jié)果逡逑本實(shí)驗(yàn)的目的基因?yàn)榭共莞熟⒒�，通過噴施１倍中劑量濃度草甘膦對轉(zhuǎn)基逡逑因植株進(jìn)行初期抗性鑒定。噴施草甘膦兩周后，由圖３．２顯示，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沾箦义隙挂呀?jīng)枯萎，轉(zhuǎn)基因大豆幼苗能夠正常生長，表現(xiàn)出明顯的草甘膦抗性。將抗性逡逑轉(zhuǎn)基因大豆幼苗移栽至人工氣候區(qū)繼續(xù)培養(yǎng)，２－３個月后，收獲轉(zhuǎn)基因大豆種子逡逑備用。逡逑３１逡逑

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