【摘要】：灰樹花(Grifola frondosa)是一種富含多糖和蛋白質(zhì)等生物活性成分的食藥用真菌,其多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化以及抗病毒等作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),灰樹花發(fā)酵胞外多糖主要為葡聚糖,其可能通過UDP-葡萄糖焦磷酸化酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化為UDP-葡萄糖,進(jìn)而經(jīng)葡聚糖合成酶聚合組裝后形成胞外多糖并分泌至胞外。因此,葡聚糖合成酶可能是灰樹花合成葡聚糖的關(guān)鍵酶之一。然而,有關(guān)灰樹花葡聚糖合成酶(Glucan synthase of G.frondosa,GFGLS)的基因結(jié)構(gòu)和功能的研究還未見報道。近年來,隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展,特別是灰樹花全基因組測序結(jié)果和功能注釋已公布,為分子水平研究灰樹花葡聚糖合成酶GFGLS的基因結(jié)構(gòu)和功能提供必要的信息資源。但目前高效改造灰樹花遺傳體系的技術(shù)手段仍十分匱乏,也限制了灰樹花中重要功能基因的研究。因此,本研究首先基于已公布的灰樹花基因組序列,設(shè)計引物并克隆GFGLS基因序列,對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析;進(jìn)而,基于反向遺傳學(xué)手段,構(gòu)建高效灰樹花基因沉默體系;最后考察GFGLS基因沉默對灰樹花深層發(fā)酵性能的影響,基本闡明灰樹花葡聚糖合成酶的在菌體生長和多糖合成中的主要功能和作用。主要研究結(jié)果如下:(1)克隆并運(yùn)用生物信息學(xué)方法系統(tǒng)分析了灰樹花葡聚糖合成酶基因GFGLS的結(jié)構(gòu)信息。獲得的GFGLS基因為全長5927 bp,與公布的灰樹花9006-11菌株的GFGLS基因同源性達(dá)到98%。其含有11個內(nèi)含子及12個外顯子,編碼蛋白序列全長為5346 bp,共編碼1781個氨基酸,分子質(zhì)量為203.66 kDa。GFGLS編碼的蛋白與擬多孔菌、云芝的葡聚糖合成酶同源性相對較高,分別為90.66%和90.38%。蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明,GFGLSp有兩個與葡聚糖合成酶基因家族一致的保守結(jié)構(gòu)域,分別位于氨基酸殘基261-369及761-1576兩個位置。親水性分析發(fā)現(xiàn),GFGLSp為膜蛋白,共含有2個大跨膜結(jié)構(gòu)域,主要包括N末端6個跨膜螺旋(TMHs)和C末端9個TMHs�？缒そY(jié)構(gòu)域由氨基酸殘基672-1253組成的親水性細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域鏈接,其中,在氨基酸殘基992-995中含有1個底物UDP-葡萄糖的結(jié)合位點。(2)建立了灰樹花反向雙元啟動子基因沉默體系。通過克隆得到GFGLS保守區(qū)域片段、灰樹花GPD啟動子片段及構(gòu)巢曲霉35S啟動子片段并成功構(gòu)建了pAN7-gfgls-dual沉默載體。優(yōu)化了制備灰樹花原生質(zhì)體的條件即:利用1%絲狀真菌破壁酶(購自Takara)和1%溶壁酶(購自廣東微生物研究所)的組合酶酶解培養(yǎng)7 d的菌絲體,酶解時間為3 h,在此條件下,原生質(zhì)體的得率和再生率分別達(dá)到最大值,為3.8×10~6個/mL和1.82%。利用電轉(zhuǎn)法成功將基因沉默載體pAN7-gfgls-dual轉(zhuǎn)入灰樹花原生質(zhì)體中,篩選得到10株轉(zhuǎn)化子,經(jīng)對標(biāo)記基因HPH的PCR擴(kuò)增證實9株呈陽性;熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化菌株iGFGLS-3中GFGLS表達(dá)量下調(diào)最為顯著,僅為0.26。(3)考察了GFGLS基因沉默對灰樹花菌體生長和發(fā)酵性能的影響。與出發(fā)株(WT)相比,基因沉默菌株iGFGLS-3在PDA平板上生長明顯變緩,7-d的平均生長率僅為3.04 mm/d,生長速率下降29.3%。WT菌絲為厚且高度分枝的表型,而iGFGLS-3菌株的長度變短,并且菌絲外觀明顯變薄。在發(fā)酵過程中,iGFGLS-3菌株的外觀呈較小尺寸的菌球形態(tài)。發(fā)酵7 d后,WT菌株的生物量和胞外粗多糖分別為25.12 g/L和1.23 g/L,基因沉默菌株iGFGLS-3的生物量和胞外粗多糖的產(chǎn)量分別降低至5.02 g/L和0.38 g/L。單糖組成分析結(jié)果表明,與WT相比,轉(zhuǎn)化菌株iGFGLS-3菌絲體粗多糖和胞內(nèi)外粗多糖的單糖組成和比例差異不顯著。因此,可以推測,灰樹花葡聚糖合成酶可能通過影響葡聚糖的合成,干擾了菌絲體骨架,最終影響菌絲體的生長。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S567.3
【圖文】：

圖 1-1 細(xì)菌多糖可能的生物合成途徑Fig, 1-1 Proposed synthesis pathway of bacterial polysaccharide圖中數(shù)字代表各類酶，分別為：1、葡萄糖激酶；2、PGM；3、UGP；4、UGE；5、PGI；6、PMI；7、PMM；8、GMPPB；9、脫水酶和 GDP-巖藻糖合成酶；10、TGP；11、鼠李糖合成酶；12、糖基轉(zhuǎn)移酶；13、聚合酶。相對于細(xì)菌多糖而言，目前食用菌多糖的研究主要集中在發(fā)酵條件、分離提取等工藝條件優(yōu)化以及精細(xì)化結(jié)構(gòu)解析、功能活性評價等方面的研究，而食用菌合成代謝途徑的研究報道十分少，且不夠深入。在借鑒細(xì)菌多糖合成途徑的基礎(chǔ)上，劉高強(qiáng)等[51]采用同位素示蹤技術(shù)結(jié)合靈芝多糖主要組分的單糖組成初步推測出了靈芝胞內(nèi)多糖 IPS-1-1 合成的方式。丁重陽等[52-53]初步構(gòu)建了靈芝發(fā)酵胞外多糖的合成途徑，基本確定 PGM、UGP、PGI 和 PMI 是影響靈芝發(fā)酵胞外多糖的單糖比例變化的重要酶類，同時也證明了葡萄糖-1-磷酸的添加抑制 PGM、PGI的酶活，對 PMI 無明顯影響。朱振元等[54]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵條件會通過擾動蛹蟲草菌絲體多糖合成途徑相關(guān)酶的基因 PGM、UGP 和 PGI 的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致其菌

圖 2-1 灰樹花 β-1,3-葡聚糖合成酶基因電泳圖lectrophoresis of β-1,3-glucan synthase genes oMaker，1 為 GFGLS1 擴(kuò)增產(chǎn)物，2 為 GFGL葡聚糖合成酶 GFGLS 基因生物信息學(xué)分3-葡聚糖合成酶 GFGLS 基因內(nèi)外顯子分NCBI 中公布的灰樹花菌株 9006-11 的在終止密碼子，含有兩個編碼蛋白的讀，這與已經(jīng)公布的其它與灰樹花同源性的葡聚糖合成酶的序列不符；進(jìn)而，利基因所編碼的蛋白與其它真菌中的葡聚缺失的分氨基酸殘基序列與內(nèi)含子預(yù)測當(dāng)前 NCBI 中有關(guān)灰樹花葡聚糖合成酶前，我們已重新注釋了 GFGLS 的內(nèi)外

氨基酸序列分析AMAN 軟件預(yù)測 GFGLS 編碼的氨基酸序列如附錄 1 中所示。該開放閱讀框（ORF）共編碼 1781 個氨基酸，ORF 起始密碼子子為 TGA。灰樹花 β-1,3-葡聚糖合成酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建測的灰樹花β-1,3-葡聚糖合成酶蛋白序列（GFGLSp）利用NCB，比對出 GFGSLp 與擬多孔菌、云芝的 GSLp 同源性相當(dāng)于較.66%和 90.38%。如圖 2-2 所示，GFGLSp 與擬多孔菌 Polyporus rametes versicolor、靈芝 Ganoderma lucidum、污叉絲孔菌 Ds、虎皮香菇 Lentinus tigrinus、擬蠟菌 Obba rivulosa、密褐褶菌 Glo、高盧蜜環(huán)菌 Armillaria gallica 的 GLSp 相似性都較好。

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本文編號：2747335