【摘要】：目的:小麥(Triticum aestivum L.)是世界上最重要的糧食作物之一。小麥籽粒中最主要的成分是淀粉,淀粉的合成途徑中有多種酶的參與。啟動子位于基因上游區(qū)域,含有能在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮重要作用的調(diào)控元件,研究淀粉合成關(guān)鍵酶基因的啟動子,有助于從源頭上了解淀粉合成關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。研究籽粒不同發(fā)育時期淀粉合成關(guān)鍵酶sssIIa和sbeIIa啟動子區(qū)域甲基化水平,分析啟動子區(qū)域甲基化的變化情況,闡明小麥淀粉合成響應(yīng)花后高溫的分子機(jī)制。方法:從小麥品種新春11號的基因組DNA中克隆sssⅡa、sbeⅡb啟動子。將克隆的啟動子與去掉35S啟動子的植物表達(dá)載體PBI221-GFP連接后在玉米葉片的原生質(zhì)體中鑒定其活性。對小麥品種新春11進(jìn)行花后高溫處理(HT)和在花前5-azaC灌根處理后再高溫處理(5azaC-HT)。用MethylTarget多重目的區(qū)域甲基化富集測序技術(shù)檢測sssⅡa、sbeⅡa啟動子區(qū)域的甲基化水平,實(shí)時熒光定量檢測sssⅡa、sbeⅡa的相對表達(dá)量。結(jié)果:(1)從小麥(Triticum aestivum L.)品種新春11號的基因組DNA中克隆了sssⅡa啟動子1862bp片段和sbeⅡb啟動子1864 bp片段。sssⅡa啟動子融合到含有GFP基因的植物表達(dá)載體后,在玉米葉片的原生質(zhì)體中瞬時表達(dá),共聚焦激光顯微鏡下觀察到熒光,克隆的sssⅡa啟動子具有啟動子活性。(2)sssⅡa和sbeⅡa啟動子區(qū)域上共檢測到410個甲基化位點(diǎn),CHG類型的甲基化有131個,CHH類型的甲基化有116個,CG類型的甲基化有163個。(3)sssⅡa和sbeⅡa啟動子區(qū)域的甲基化水平經(jīng)HT處理后有16個位點(diǎn)發(fā)生顯著變化,經(jīng)5azaC-HT處理后有14個位點(diǎn)發(fā)生顯著變化,HT與5azaC-HT兩種不同的處理間有17個位點(diǎn)差異顯著。(4)HT處理后sssIIa、sbeIIa相對表達(dá)量在花后15天和20天較高,5azaC-HT處理后sssIIa、sbeIIa相對表達(dá)量在花后10天較高。(5)HT處理使小麥總淀粉含量在各個時期均低于CK,5azaC-HT使小麥總淀粉含在花后10天、15天時高于CK和HT。但在后期小麥淀粉含量均低于CK和HT,對淀粉含量的提高作用不明顯。結(jié)論:小麥籽粒在不同發(fā)育時期甲基化水平不同。小麥淀粉合成響應(yīng)花后高溫時,高溫使基因啟動子的區(qū)域甲基化位點(diǎn)的水平上升或者下降,甲基化水平升高,與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力下降,甲基化水平降低,與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力升高,調(diào)控基因的表達(dá)影響淀粉含量。5-azaC甲基化抑制劑使高溫對啟動子區(qū)域甲基化作用的位點(diǎn)發(fā)生改變。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S512.1
【圖文】：

第二章 sssⅡa、sbeⅡb 啟動子的克隆與瞬時表達(dá)2.1 材料與方法2.1.1 材料與種植供試材料選取新疆主栽春小麥品種新春 11 號，中筋中熟，喜冷涼，抗倒伏能由石河子大學(xué)麥類作物研究所提供 2016 年夏收的種子。將飽滿的小麥種子置于發(fā)芽盒內(nèi)，底部鋪上三層濾紙無菌水潤濕，腹溝朝下，一層濕潤濾紙。將發(fā)芽盒放在光照培養(yǎng)箱（GZP-250A 型）中，21℃暗培養(yǎng)，每天無菌水，三天后去掉上層濾紙。將 8d 后的黃化葉片作為提取 DNA 的材料。2.1.2 菌株和載體大腸桿菌感受態(tài) Trans-T1 phage Resistant Chemically Competent Cell -80℃保存式金公司）、克隆載體 pEASY-T1 Simple Cloning Kit-20℃保存（全式金公司）、表體 pBI221-GFP（達(dá)爾文公司）-20℃保存。

cis-acting regulatory element involved in the 參與茉莉酸甲酯反應(yīng)的順式調(diào)控元件cis-acting regulatory element essential for the厭氧誘導(dǎo)的順式作用調(diào)節(jié)元件gibberellin-responsive element赤霉素響應(yīng)元件cis-acting regulatory element required for end胚乳表達(dá)所必需的順式作用元件core promoter element around -30 of transcrip在轉(zhuǎn)錄起始位核心啟動子動子的克隆，2.2.5.1 的反應(yīng)體系，對小麥基因組 DNA 進(jìn)瓊脂糖的電泳結(jié)果見圖 2-1，退火溫度為 6b 啟動子梯度 PCR 后，1%瓊脂糖的電泳結(jié)后面的溫度，只有當(dāng)溫度為 56.5℃時引物二

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2741053